高通量药物筛选_图文.pptVIP

(3)竞争法测抗原1）抗体固相测抗原 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。 原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。 方法：抗体包被→封闭→同时加入待测抗原和酶标抗原→洗涤→酶底物→显色→ 检测2）抗原固相测抗原 原理是标本中的抗原和固相抗原与一定量的抗体竞争结合。标本中抗原含量愈多，结合在固相上的抗体愈少，最后的显色也愈浅。  方法: a: 抗原包被96孔板；? ?b:封闭; c: 待测抗原与抗体反应一定时间；? ?d: 加入96孔板 e: 洗涤? ?? ?? ?? ?? ???f：加入酶标二抗 g：洗涤? ?? ?? ?? ?? ?h：显色和检测  （二）细胞水平的药物高通量筛选模型 　　a. 内皮细胞激活 内皮细胞激活是急慢性炎症过程中重要环节。Rice等以Ｅ选择蛋白在细胞表面的表达作为标志，建立了内皮细胞激活抑制剂的高通量筛选方法。建立人脐静脉内皮细胞培养系统。IL-1刺激下，Ｅ选择蛋白在内皮细胞表面的表达用ELISA方法定量。方法包括细胞固定、加液、加受试化合物等操作，能保持细胞完整，不昂贵，可重复，筛选速度可达每星期1000种化合物。能够较早地发现细胞对化合物的摄取及化合物的细胞毒性。 　　 b. 细胞凋亡 Erusalimsky等建立。细胞预先用3Ｈ 胸苷标记，与凋亡诱导物孵育后，连续经过两种玻璃滤器。一个是中性的，捕获完整的染色质和高分子量ＤＮＡ。另一个装有DEAE活性基团，捕获低分子量DNA碎片。通过对滤器上放射性的测量，可以对DNA的破碎情况定量。 c. 抗肿瘤活性 Lu等建立 “生物活性指纹”筛选抗肺癌药物的方法，考察受试分子(类维生素Ａ及类维生素Ａ相关分子)对许多不同细胞系的效应特点。检测指标包括： (1)肺癌细胞生长抑制检测。选择了约50种肿瘤和非肿瘤细胞，包括了大量不同的组织和(或)肿瘤来源。细胞暴露于受试化合物5ｄ后，用标准比色法测定存活细胞百分率。20%生长抑制率指示有活性。 (2)集落形成抑制检测，用以区分细胞生长抑制作用和细胞杀伤作用。6孔板上加NCI-H292肺癌细胞，暴露于受试物一定时间。然后对细胞进行清洗，植于无受试物的培养介质共7d。用结晶紫对细胞染色，考察集落形成情况。 (3)凋亡检测，用ELISA方法测量细胞DNA破碎。 (4)转录调控检测，用以考察受试化合物是否有类维生素Ａ受体介导的转录抑制作用。方法是将HeLa TK-细胞用73Col-CAT报告基因连同受体的表达载体转染，与受试物一起培养，用ELISA方法检测CAT活性。 d. G2检查点(G2 checkpoint) Roberge等建立了G2期检查点抑制剂的高通量筛选方法。将MCF-7m p53细胞培养，种在96孔聚苯乙烯组织培养板上。照射使细胞进入G2静止期，加入受试化合物用ELISA方法检测核仁蛋白(nucleolin)的磷酸化形式，从而得到从G2期释放进入Ｍ期的细胞数量，即抑制G2检查点程度。 细胞周期分为四个阶段：即G1期(DNA合成前期)、s期(DNA合成期)、G2期(DNA合成后期)和M期(有丝分裂期)。G0期细胞也称休眠细胞。 　　 e. 信号转导通路 Su等建立了TGFβ3通路作用物的高通量筛选方法。构建融合报告基因，转染细胞，选择虫荧光素酶表达能被TGFβ高诱导的克隆。将细胞植于96孔板，与受试化合物孵育后，稀释并加入Steady-Glo底物测虫荧光素酶活力，与对照比较，计算相对酶活性增加值。 　 f. 细菌蛋白分泌 Alksne等建立了以抑制细菌蛋白分泌为作用方式的新型抗生素的高通量筛选方法。该方法基于SecA-lacZ融合报告基因。SecA是一种自我调控翻译的蛋白，当细菌蛋白分泌被干扰时，该报告基因被诱导。 　　 g. 细菌生长 Chung等建立了抑制分枝杆菌生长化合物的高通量筛选方法。选择了一种腐生性分枝杆菌代替结核分枝杆菌，因其具有生长迅速以及非感染性的特点。通过测定细胞摄入放射性标记的尿嘧啶，考察受试化合物对分枝杆菌活力的作用。 　2．生药活性成分的高通量筛选