基于SOE-PCR的两种鱼类hepcidin基因串联及其在.PDF

682 生 物 工 程 学 报 李文婧 等/基于 SOE-PCR 的两种鱼类 hepcidin 基因串联及其在毕赤酵母中的表达 Chinese Journal of Biotechnology /cjbcn May 25, 2015, 31(5): 682−691 DOI: 10.13345/j.cjb.140443 ©2015 Chin J Biotech, All rights reserved 海洋生物技术 SOE-PCR hepcidin 1 1 1 2 李文婧 ，陶妍 ，赵冬梅 ，徐冰冰 1 201306 2 226400 , , , . SOE-PCR hepcidin . , 2015, 31(5): 682–691. Li WJ, Tao Y, Zhao DM, et al. Connection of hepcidin genes from two fish species and their expression in Pichia pastoris . Chin J Biotech, 2015, 31(5): 682–691. 摘 要: Hepcidin 抗菌肽是由生物肝脏细胞表达的一类具有抗菌作用和铁代谢调节功能的碱性小分子肽，它们 在机体免疫系统中发挥了重要作用，被认为是抗生素的理想替代品。通过重组DNA 表达技术制备抗菌肽无疑 是一条良好的途径。为扩大hepcidin 的抗菌谱和提高其表达量，通过SOE-PCR 将斑点叉尾 Ictalurus punctatus 鮰 hepcidin 成熟肽的cDNA“mCH”与尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus hepcidin 成熟肽的cDNA“mTH”进行串联， 并在两端分别添加 EcoR Ⅰ和 Not Ⅰ酶切位点，以 pPIC9K 为真核表达载体，成功构建了“pPIC9K-mCH-mTH” 重组表达载体；电转化进毕赤酵母GS115 中，经不同浓度G418 和选择性培养基筛选以及对酵母基因组DNA 的PCR 鉴定，得到高拷贝酵母转化子；在30 ℃、以1%的甲醇诱导表达不同时间后，经Tricine-SDS分 析，表明发酵培养72 h 时目的蛋白的表达量最高，达77 mg/L 。发酵上清经SP-Sepharose 阳离子交换层析纯化 后获得高纯度的目的蛋白。抑菌实验显示含目的蛋白的发酵上清和经纯化后的重组目的蛋白对革兰氏阳性和革 兰氏阴性细菌都有良好的抑菌效果。本研究结果为hepcidin 抗菌肽的产业化生产奠定了良好的基础。 : 抗菌肽，Hepcidin 成熟肽，毕赤酵母，SOE-PCR Received: September 10, 2014; Accepted: November 15, 2014 Supported by: the Industry-University-Research Cooperation of Shanghai Municipal Education Commission (No. 15CXY30), Foundation of Key Laboratory of Urban Agriculture (South), Ministry of Agriculture, P. R. China (No. UA201307). Corresponding author: Yan Tao. Tel: +86-21 E-mail: ytao@ (No. 15CXY30) ( )