血管内皮细胞损伤差异蛋白表达谱研究.pdfVIP

血管内皮细胞损伤的差异蛋白表达谱研究 1 1 1 1 1 张霁 ，王玉芳 ，李英碧 ，吴谨 ，侯一平 1 四川大学华西基础医学与法医学院, （610041 ） 通讯作者：侯一平 E-mail: forensic@ 摘要 本文作者利用蛋白质组学研究的理论和技术，对 Hcy 作用后的人脐静脉内皮细胞 （HUVEC ）的蛋白质表达谱进行观察和分析，寻找与Hcy 作用相关的蛋白质改变，了解 Hcy 所引起的细胞内功能蛋白的变化，为 Hcy 致血管内皮损伤机制的研究提供新的数据。 作者采用2DE-MS 技术路线对Hcy 作用下的HUVEC 蛋白质表达谱进行了研究，获得了正 常血管内皮细胞蛋白表达谱，以及损伤血管内皮细胞的差异蛋白表达谱，并运用质谱技术成 功鉴定了差异表达蛋白，为今后的深入研究奠定了基础。 关键词：同型半胱氨酸；人脐静脉内皮细胞；蛋白质组学。 引言 同型半胱氨酸是一种含硫氨基酸，体内不能合成，只能来源于蛋氨酸的分解代谢，主要 以蛋白结合形式存在于体内。同型半胱氨酸的生理作用是参与体内转硫通路，在甲基转移酶、 亚甲基四氢叶酸降解酶、叶酸以及胆碱等的参与下，将来源于食物的四碳氨基酸转变为三碳 氨基酸；也可以再甲基化形成蛋氨酸。正常人体内同型半胱氨酸含量极低，而在一些遗传性 疾病、代谢性疾病、心脑血管疾病以及慢性肾脏疾病中会显著增高，称高同型半胱氨酸血症 [1] [2] 。1969 年 McCully 首次提出高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化有关 。20 世纪 90年代 以后，国内外学者的大量研究表明，高同型半胱氨酸血症与动脉粥样硬化[3,4,5]、冠心病[1, 6]、 脑血管病变[7]、糖尿病性血管病变[8, 9]、老年痴呆症明显相关[10-13]。多数学者认为，同型半 胱氨酸浓度升高可以作为导致心血管疾病的独立危险因素之一。因此，对同型半胱氨酸在各 种心脑血管疾病发生发展过程中所发挥作用的深入研究具有重要的理论和应用价值。 在本课题以体外培养的人脐静脉内皮细胞为研究对象，利用双向电泳技术研究同型半胱 氨酸作用于内皮细胞后蛋白质表达谱的改变情况，以期从分子相互作用的整体角度对同型半 胱氨酸对内皮细胞损伤的分子机制做深入研究。 1 本课题得到教育部博士点专项基金资助（20020610044 ）。 - 1 - 1. 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂： 本文所用关键试剂如下：尿素、CHAPS 使用 Amersham-Pharmacia 公司 PlusOne 级超纯 试剂；DTT 、溴酚兰、Tris、碘乙酰胺、SDS、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺使用 Sigma 公司分析纯；pharmalyte pH3-10 、IPG Buffer pH3-10 NL 、Immobiline DryStrip pH 3-10 NL 预 制胶条为 Amersham-Pharmacia 公司产品。 1.1.2 主要设备： 蛋白质双向电泳系统：本次研究主要使用 Amersham-Pharmacia 公司的蛋白质双相电泳 系统，包括 IPGphor 等电聚焦电泳仪、Ettan 垂直电泳系统、透射式凝胶扫描仪、图像分析 系统等。 大分子生物质谱：Bruker 公司 BIFLEX-III 型 Maldi-TOF 质谱仪。 其他设备：包括低温高速离心机，4-60 ℃高精度恒温水浴箱等。 1.1.3 人脐静脉血管内皮细胞 本次实验所使用的人脐静脉内皮细胞均为本实验室自行培养，使用第 3-4 代细胞进行各 项实验。 1.2 方法 1.2.1