荧光定量PCR原理和应用-LQ探析.ppt

December,2004 实时荧光定量PCR原理及应用 刘倩 公式推导: 相对定量——通过 内标基因定量 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小 内标数量代表样本中所含细胞或基因组数量 对样品量校正：目的基因数量/内标基因 内标通常选用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因 利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异-双标准曲线法 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准 选用GAPDH作为内标基因 FAM标记的ERBB2探针 VIC标记的GAPDH探针 标准品（质粒）构造标准曲线 多重PCR反应 阴性对照 无RNA对照（空白） 无逆转录酶对照（监控基因组污染） 标准曲线 样品扩增：正常vs肿瘤 实验结果 实验结果 2-ΔΔc(t) 法 ΔΔC(t)=4.41-5.18 =-0.77±0.18 2-ΔΔc(t) =1.51－1.93 结果与双标准曲线法相近 定性分析： 点突变分析 等位基因型分析 DNA甲基化分析 SNP分析 熔解曲线分析 两条探针分别针对不同等位基因 SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ* 等位基因型分析的原理与点突变分析方法相同 SNP分析