分析化学教研室第十二章高效液相色谱法.ppt

与经典液相色谱法相比 颗粒极细（一般为10?m以下）、规则均匀的固定相，(键合相)传质阻抗小，柱效高，分离效率高； 高压输液泵输送流动相，流速快，分析速度快； 高灵敏度检测器，灵敏度大大提高。紫外检测器最小检测限可达10?9g，而荧光检测器最小检测限可达10?12g。 影响容量因子的因素 离子对试剂的种类和浓度：碳链长度增加，溶质的k增大；在一定范围内试剂的浓度升高，溶质的k增大 流动相的pH：有利于组分和离子对试剂离子化时（离子对的形成），组分的k值最大 固定相 、流动相性质（同一般RP-HPLC）。 3.梯度洗脱 这种洗脱方式主要应用于分离分配比k相差很大的复杂混合物。 在同一个分析周期中，按一定程度不断改变流动相的浓度配比，称为梯度洗脱。从而可以使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。 HPLC有等度洗脱和梯度洗脱两种洗脱方式。 常向流动相中加入0.1%∽1%的醋酸盐、磷酸盐可减少残余硅醇基的作用，抑制峰形拖尾，并改善分离效果 A溶剂为高强度（甲醇或乙腈）B溶剂为低强度（水） A% A% A% A% 设定30分钟的时间，梯度为从甲醇比例从5％过渡至80％，然后根据所得的图谱分析这个梯度，若前面没出峰可加大甲醇比例至10％，20％，若图谱中峰集中在某个时间段，则应把这个时间段的比例变化拉的更缓些，其它时间段变化可快一些。 色谱分析条件：? Kromasil C１８色谱柱(4.6mm×20mm，5μm)，流动相：甲醇(A)-水(B)梯度洗脱，0～15min(56%A，44%B)，15～50min(56%～５９％Ａ，４４％～４１％Ｂ），５０～５６min(59%～６５％Ａ，４１％～３５％Ｂ），５６～６５min(65%～67%A，35%～33%B)，65～100min(67%～８５％Ａ，３３％～１５％B)；柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长254mm。见图。 运用梯度洗脱分离五味子水煎物的各类成分 ???????????????????? ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? a 五味子水煎液? b对照品?(1五味子醇甲，2五味子甲素，3五味子乙素) 第5节 分析方法 一、定性分析 1．利用标准品对照定性 （1）利用保留时间的一致性定性 （2）利用加入标准品增加峰高法定性 2．利用检测器的选择性定性 3．利用色谱-光谱联用技术定性 二、定量分析 1．归一化法 2．外标法 3．内标法 一、吸附色谱法 固定相：固体吸附剂为硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂. 有时也用高分子多孔小球（吸附+分配并兼有小孔凝胶作用） 以固体吸附剂为固定相，基于其对不同组分吸附能力的差异进行混合物的分离。 流动相：常用混合溶剂，主体溶剂为正己烷或环己烷，以一氯甲烷、二氯甲烷、三氯甲烷或丙酮等作为调节剂，用于调整流动相的极性。 a.表面多孔型 b.无定形全多孔 c.球形全多孔 d.堆积全多孔 应用：主要用于分离能溶于有机溶剂的极性与弱极性混合物及异构体的分离。 二、化学键合相色谱法 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法，简称键合相色谱法。 强极性组分后出峰，弱极性组分先出峰 （一）化学键合固定相 用化学反应的方法将有机分子键合在载体表面上，所形成的填料称为化学键合固定相，简称键合相。 化学键合相已广泛用于正相与反相色谱法、离子对色谱法等诸多色谱法中。 1、键合反应 化学键合相的载体是硅胶，表面有≡Si—OH，能与合适的有机化合物反应，使具有不同极性功能团的有机分子键合在表面而获得不同性能的化学键合相，它的制备方法主要是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应（硅烷化 ），生成Si-O-Si-C键合相。 由于空间位阻效应，不可能将较大的有机官能团键合到全部硅醇基上，使得部分硅醇基未反应。 残余的硅醇基对键合相的性能有很大影响，它可以减小键合相表面的疏水性，对极性溶质产生次级化学吸附，从而使保留机制复杂化，降低了键合相填料的稳定性，使组分的峰形拖尾。为尽量减少残余硅醇基，一般在键合反应后，要用小分子三甲基氯硅烷等进行钝化处理，称封尾。 2. 键合相的分类 　　这类键合相表面基团为非极性烃基，如十八烷基、辛烷基、甲基与苯基等。十八烷基键合相（ODS）是最常用的非极性键合相。 （1）非极性键合相 1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯 固定相：C1 固定相：C8 固定相：C18 非极性键合相