微生物菌种保藏.PDF

微生物菌种保藏 一、实验目的及要求  1.了解并掌握菌种保藏的常用方法及 其优缺点。  2.学习斜面传代保藏方法、液体石蜡 保藏方法、冷冻干燥保藏方法。 二、实验器材  1.大肠杆菌、酵母菌、放线菌和青霉菌斜 面。  2.无菌水、液体石蜡、脱脂奶粉、10%HCl、 干冰、95%乙醇、Nacl、移液器、接种环、 安瓿管、冰箱、冷冻真空干燥装置、酒精 喷灯、三角烧瓶(250mL)。 三、操作步骤 (一)斜面传代保藏法 l．斜面接种 将待保藏的菌种用接种环以无 菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母 菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真 菌宜采用成熟的孢子。  2．贴标签 取各种无菌斜面试管数支，将 注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管 斜面的正上方，距试管口2 －3cm处。  3．培养 细菌37℃恒温培养18－24h，酵母菌于 28 －30℃培养36 －60h，放线菌和丝状真菌置于 28℃培养4 －7d。  4．保藏 斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。 为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包 扎，或换上无菌胶塞。   酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保 存2－6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好 每月移种一次。  (二)液体石蜡保藏法  l．液体石蜡灭菌 在三角瓶中装入适量液体石蜡，塞上 棉塞，牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，然后置105－ 110℃烘箱中lh，以除去石蜡中的水分，备用。  2．接种培养 同斜面传代保藏法。  3．加液体石蜡 用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加 到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为 宜。  4．保藏 棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱 中保存。霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵 母菌可保藏1－2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。 (三)冷冻干燥保藏法  1．准备安瓿管 选用内径5mm，长10.5cm的硬质 玻璃试管，用10%HCl浸泡8 －10h后用自来水冲洗 多次，最后用去离子水洗1－2次，烘干，将印有 菌名和接种日期的标签放人安瓿管内，有字的一 面朝向管壁。管口加棉塞，121℃灭菌30min。  2．制备脱脂牛奶 将脱脂奶粉配成20%乳液，然 后分装，121℃灭菌30min，并作无菌试验。  3．准备菌种 选用无污染的纯菌种，培养时间： 一般细菌为24－48h，酵母菌为3d，放线菌与丝 状真菌7－10d。  4．制备菌液及分装 吸取3mL无菌牛奶直接加入 斜面菌种管中，用接种环轻轻搅动，再用手摇动 试管，制成均匀的细胞或孢子悬液。用无菌长滴 管将菌液分装于安瓿管底部，每管装0.2mL。  5. 预冻 将安瓶管浸入装有干冰和95%乙醇的预 冷槽中，(此时槽内温度可达-40 －-50℃)，冷冻 1h左右，即可使悬液冻结成固体。  6. 真空干燥 保持安瓿管内的悬液仍呈固体状 态。开启真空泵后，使被冻结的悬液开始升华， 冻结样品逐渐被干燥成白色片状，此时使安瓿管 脱离冰浴，在室温下(25~30℃)继续干燥。  7．封口样品 干燥后继续抽真空达1.33Pa，在 安瓿管棉塞的稍下部位用酒精喷灯火焰灼烧，拉 成细颈并熔封，然后置4℃冰箱内保藏。 四、注意事项  1．从液体石蜡封藏的菌种管中挑菌后，接种环 在火焰上灭菌时要先在火焰边烤干再直接灼烧， 以免菌液四溅，引起污染。  2．真空干燥过程中安瓿管内样品应保持冻结状 态，以防止抽真空时样品产生泡沫而外溢。  3．熔封安瓿管时注意火焰大小要适中，封口处 灼烧要均匀，若火焰过大，封品处易弯斜，冷却 后易出现裂缝而造成漏气。 五、实验报告  1．结果 接种 菌种名称 培养条件 保藏 保藏 操作 日期