实验蛋白质的提取及sds聚丙烯酰胺凝胶电泳.ppt

实验仪器、材料、试剂 1、仪器：微量移液器、电泳槽、电泳仪、凝胶 成像系统等。 2、材料：细菌蛋白质。 3、试剂：标准相对分子质量的蛋白质样品、 30%丙烯酰胺、10%SDS、10%过硫 酸铵、 TEMED、Tris-HCl、电泳缓冲 液、上样缓冲液等。 1、安装电泳槽装置：根据产品说明书安装电泳槽装置，根据玻璃板的大小和间隔片的厚度计算所需凝胶的体积。 实 验 步 骤 2、聚丙烯酰胺凝胶的配制： 实 验 步 骤 5%的浓缩胶 去离子水 2.7mL 30%丙烯酰胺 670μL 1.5mmol/L Tris-HCl (pH8.8) 500μL 10% SDS 40μL 10%过硫酸铵 40μL TEMED 4μL 凝胶体积 4mL 实 验 步 骤 12%的分离胶： 去离子水 3.3mL 30%丙烯酰胺 4.0mL 1.0mmol/L Tris-HCl (pH6.8) 2.5mL 10% SDS 100μL 10%过硫酸铵 100μL TEMED 4μL 凝胶体积 10mL 分离胶混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面保持水平，凝胶完全聚合30-60min。将分离胶上的水倒去，加入浓缩胶，立即将梳子插入玻璃板间，小心勿使梳齿下留有气泡，完全聚合需15-30min。 实 验 步 骤 3、样品处理：将样品中加入SDS上样缓冲液，100℃加热5min，离心，取上清液作SDS分析，同时将SDS分子量蛋白标准品作平行处理。 4、上样：将样品加入样品孔中，并加入蛋白质分子量标准品作对照。 实 验 步 骤 5、电泳：在电泳槽中加入电泳缓冲液，连接电源，电泳时，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端时停止。 6、染色：将胶从玻璃板中取出，加入考马斯亮蓝染色液，在摇床上室温振荡染色4-6h。 实 验 步 骤 7、脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中振荡脱色，多次更换脱色液至蛋白条带清晰。 8、凝胶摄像和保存：在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果保存于电脑中。凝胶可保存于双蒸水中或7%乙酸溶液中。 实 验 步 骤 注 意 事 项 分离胶混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面保持水平。 思 考 题 1、浓缩胶和分离胶分别发挥的作用。 L/O/G/O 教师：李洪丽 电话实 验 四 蛋白质的提取及 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 内容一：细菌总蛋白的提取 实验目的 实验原理 实验仪器、材料、试剂 实验步骤 1 2 3 4 注意事项 思考题 5 6 实 验 目 的 了解蛋白质提取的基本原理。 学习细菌总蛋白的提取方法。 实 验 原 理 蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。 一、利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等； 实 验 原 理 二、将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。 实 验 原 理 蛋白质的制备一般分为以下四个阶段： 选择材料和预处理； 细胞的破碎及细胞器的分离； 提取和纯化； 浓细、干燥和保存。 实 验 原 理 实验仪