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用地衣红染色法评价猪卵母细胞核成熟 卢庆，葛立军，高俊锋，曹爱巧，剧世强，芮荣* 南京农业大学动物医学院，南京（210095 ） E-mail ：rrui@ 摘 要：用 0.1%地衣红对猪卵母细胞进行染色检查，分析不同层数卵丘细胞对卵母细胞成 熟的影响。结果显示，3 层及3 层以上卵丘细胞包被的猪卵母细胞核成熟率为64.7% ，明显 高于3 层以下卵丘细胞包被的卵母细胞或裸卵的核成熟率（分别为56.3%和33.3% ）；3 及3 以上卵丘细胞包被的卵母细胞卵裂率和16 细胞胚发育率均为最高，分别为66.7%和37.0%。 表明卵丘细胞对猪卵母细胞的核成熟及卵母细胞体外受精后的卵裂和早期胚胎发育，都具有 明显的促进作用。地衣红染色检查与其他成熟判断法相比，结果比较准确、重复性好。 关键词：地衣红染色，卵母细胞，核成熟，猪 胚胎体外生产（IVP ）主要包括卵母细胞体外成熟（IVM ）、体外受精（IVF ）和其后的 体外培养（IVC ）等技术环节。猪IVP 的效率与体内发育能力相比一直处于较低水平，其原 因较为复杂，包括卵母细胞IVM不完全、精液质量不佳、多精受精或培养条件不合适等等。 从后续培养的结果来看，卵母细胞的来源和成熟质量仍为影响体外生产的关键环节[1] 。经过 不断的技术改进，以TCM-199为基础的成熟培养液现已被广泛应用于猪卵母细胞的体外成 熟。在本实验室所获得的猪卵母细胞卵丘扩散率可基本稳定在80%左右；但有学者认为，卵 丘扩散并不能完全代表卵母细胞成熟[2] 。如何评价卵丘包被对卵母细胞体外成熟的作用，正 是本实验研究的目的所在。通过用地衣红染色法分析不同的卵丘包被条件对卵母细胞成熟发 育的影响，以期改进猪卵母细胞核成熟评价方法。 1. 材料与方法 1.1 猪卵母细胞采集 从屠宰场采集猪卵巢，置于盛有37℃生理盐水（含青霉素、链霉素各500 IU/mL）的保 温瓶内，于2.5 h 内送达实验室。将卵巢用添加1%新生牛血清（NCS ）的改良杜氏磷酸盐缓 冲液（mPBS ）洗3-4 次后用于采卵。采用抽吸法采集卵巢表面直径2-5 mm 卵泡卵母细胞， 用带有8 号或12 号针头的注射器抽吸卵巢表面卵泡中的卵母细胞，抽吸的卵母细胞缓缓注 入10 mL 离心管中，37 ℃静置5 min，弃去上清；含卵母细胞的沉淀用少量mPBS 液重新悬 浮后转入10 cm 培养皿内，于实体显微镜下检卵。所获裸卵或卵丘-卵母细胞复合体（COC ） 用mPBS 洗2-3 次后，再用TCM199 培养液1-2 次备用。 1.2 卵母细胞体外成熟培养 成熟培养液为TCM199，添加10% NCS、10%猪卵泡液（pFF ）、10 IU/mL 孕马血清促 性腺激素（PMSG ）、10 IU/mL 人绒毛膜促性腺激素（hCG ）、69µg/mL L-半胱氨酸、1µg/mL 17β-雌二醇(E2) 、0.36mg/L 丙酮酸钠、1mL/L 乳酸钠、100IU/ml 青霉素钠和100IU/mL 硫酸 链霉素[3] 。采用微滴法进行体外培养，制作100 µl 成熟培养液滴，上盖石蜡油，在CO2 培养 箱内隔夜平衡。每100 µl 微滴中放入约15 枚卵母细胞，于38.5℃、5%CO2 气相和饱和湿度 本课题得到上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字[2003]第14－1 号) ，国家自然科学基金和 江苏省自然科学基金(BK2002108)的资助。 作者简介：卢庆（1982－），硕士研究生，研究方向为动物生殖生物学。*通讯作者 - 1 - 的CO2 培养箱中培养44 h 。 1.3 地衣红染色法 完全除去卵丘细胞的卵母细胞在 PBS 液中洗 2 次，置于 2.5% 戊二醛溶液中固定 30s-1min 。取出后移至生理盐水或PBS 液中洗1-2 次；在载玻片中央约为盖玻片大小的区域、 相当于其4 个角的位置，点上少量凡士林；将卵母细胞集中置于凡士林4 个点的中央；放上 盖玻片，于镜下轻压，并用生理盐水充满盖玻片。