酿酒酵母ADH3基因的敲除.pdfVIP

第36卷第4期 工业微生物 Vd．36No．4 2006年12月 Industrial Dec．2006 Mi∞biology 酿酒酵母ADH3基因的敲除* 宋浩雷， 郭晓贤， 杨月梅， 江贤章，黄建忠一 (福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心，福建师范大学，福州350007) 摘要 酿酒酵母YS3(a旃口r07723优s 点，获得伽单倍体缺陷型茵株。利用同样的方法再次敲除双倍体的另一个等位基因。最终获 得ADH3双倍体基因缺陷型突变株Y一ADI鹄。 关键词：酿酒酵母； 乙醇脱氢酶；√6圆H3；基因敲除； PCR 酿酒酵母(＆c疏口砌％馏s册℃谪缸P)是重要的具有抗性，同时脚携带G418抗性基因，两端带 模式生物[1]，具有广泛的科研应用价值，其基因组序 列已经全部完成[2]，并且80％基因功能已得到鉴导表达产cre酶，带有腐草霉素筛选标记，在Ⅵ)D 定。乙醇脱氢酶ADH3具有催化乙醇分解的生物培养基连续传代可以丢失质粒。 学功能，可降低酵母细胞乙醇产率。建立快速高效 1．1．2酶和主要试赉3 的基因功能分析技术，对酵母基因组新功能基因的 Ex 鉴定具有重要意义。以PCR为基础的基因敲除方 法，尤其是loXP—Marker—loXP序列组件和C叫 loXP系统应用是酿酒酵母基因功能鉴定的有效技试剂均购于Takara公司或Si舯a公司。 术手段旧J。为利用同源重组敲除基因，实现酵母未 1．1．3引物设计 t 知功能基因的快速鉴定，并提高酵母乙醇的合成，本 根据图1，设计4对引物(表1)。 文利用Cre／lo)cP系统和Kan7(卡那)筛选标记，建立 了√虹)H3基因敲除的技术方法，获得ADH3基因缺 失的酿酒酵母突变株YS—AⅨB。 1材料与方法 1．1材料 图1 引物设计原则和要求 1．1．1菌种及质粒 酿酒酵母(＆c咖口r0哟嬲凹愆说si口P)YS3和大 肠杆菌DH5a由福建师范大学生命科学学院菌种保 外19个和22个序列是扩增质粒上筛选标记基因的上下游引物。 1．1．4主要仪器与设备 藏中心提供。质粒pUG6、pSH65购于德国EUR。 OSCp心[41(http：／／、veb．uni—frankfurt．de／fbl5／ 有限公司) r11ikro／euroscarf／)，它们在大肠杆菌中对氨苄青霉素 *福建省科技重大专项(05}亿101070193)资助 **通讯作者，电话：0591E—n血：hjz@fjnu．edu．cn 作者简介：宋浩雷(1976～)，男，工程师，硕士。 万方数据 一28— 第4期 宋浩雷，等：酿酒酵母ADH3基因的敲除。 第36卷 2720Them诅l 1．2．3酵母茵ADH3基因存在验证 Cycler(AppliedBiosyst∞1S) 80—2114—98 GendQI塌nt p1D(AmerShamBi06cienoes) 表1 引物序列 p血ner 5’ sequence 3’ tag∞ag群呦ctcgctttatctcttq弘ccg蛆tt诅cta诅c