第五章 灭菌工程及空气净化.doc

第五章 灭菌工程及空气净化 PAGE PAGE 66 第五章 灭菌工程及空气净化 第一节 灭菌工程 一、空罐灭菌 1、目的： 1）消除罐内死角，确保下一批发酵的成功 2）杀灭与罐直接相通的各管路、阀门的微生物 3）杀灭上批发酵的活的微生物，减轻环境污染 2、步骤：（热蒸汽法） 1）先彻底清洗 作用：a）有利于消除死角 b）免于料受热（尤其是干热的部位）干焦于罐体、管或阀门 2）从底部通入蒸汽 3）排冷气 4）升压 打开各个需灭菌的管路、放气阀等（如接种管、取样管、空气进管、流量计等） 5）保压 通常1kg/cm2, 30～60min 6) 降温 关闭各放气阀，切断汽源，慢慢放气；或自然冷却，或泵循环水加速冷却 Notes: a）确保无死角产生 b）也可采用甲醛蒸煮或熏蒸的方法 c）勿激碎视镜 二、培养基灭菌的有关理论 一）加热灭菌原理 1、微生物的热阻 每一种微生物都有一定的生长温度范围；当微生物处在最低生长温度以下，代谢作用几乎停止，而处于休眠状态；当温度超过最高限度时，细胞中原生质体和酶的基本成分就发生不可逆的变性，使微生物死亡。 不同种类微生物对热的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力称为热阻（heat resistance）。 1）致死温度（Death temperature） ——杀死微生物的极限温度称为致死温度。 2）热力致死时间 (Thermal Death Time; TDT) —— 在特定条件、特定温度下，杀死某种微生物所需的最短时间。 e.g 伤寒杆菌58℃ 30min 变形杆菌55℃ 60min 3）D值 ——利用一定温度进行加热, 90%的活菌被杀死时所需的时间(min)即为D值。又称1/10衰减时间。（图1） 图1 图1 残存活细胞曲线 例：含有某种细菌的悬液，含菌数为105/ml,在100℃（212°F）的水浴温度中，活菌数降低到104/ml时所需的时间为10min,则该菌的D值即为10min。 D100 = 10min 如果加热的温度为121℃，则常写成Dr 4）Z 值 ——在加热致死时间曲线中，加热时间缩短90%所需升高的温度，即为Z值。 图2加热致死时间曲线 图2 加热致死时间曲线 2、微生物的热死规律——对数残留定律 微生物的热死是指微生物的受热失活，但物理性质不变。微生物虽然是一复杂的高分子体系，但受热死亡是由于蛋白质变性所致。在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论。 对数残留定律的概念：——对微生物进行湿热灭菌时，培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 数学表达式：- dN/dt = kN N —— 培养基中活的微生物个数； t —— 时间（s）; k —— 比死亡速率（s-1） (死亡速率常数) dN/dt —— 微生物的瞬间变化率，即死亡速率 t = 2.303/k·logN0/N 可见灭菌时间取决于污染程度(N0)、灭菌程度（残留菌数N）和k值。在培养基中有各种各样的微生物，不可能逐一加以考虑。一般只考虑芽孢细菌和细菌的芽孢数之和作为计算依据。灭菌程度，即残留菌数，如果要求完全彻底灭菌，即N = 0，则t 为∞，上式无意义，事实上也不可能。一般取N = 0.001，即1000次灭菌中有1次失败。 例：有一发酵罐内装40m3培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，121℃时灭菌速度常数为1.8min－1。求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。 解：N0 = 40×106 × 2×105 = 8 ×1012 (个) N = 0.001; k = 1.8 (min－1) t =20.34 (min) 3、死亡速率常数k （比死亡速率） 死亡速率 常数 k 是微生物耐热性的一种特征，它随微生物种类和灭菌温度而异。相同温度下，k值越小，则此微生物越耐热。在121℃，细菌芽孢的k值约为1min-1,而营养细胞的k值为10-1010min-1。 4、培养基灭菌温度的选择 培养基灭菌过程中，除微生物被杀死外，还伴随着培养基成分被破坏，在加热下氨基酸、维生素等受破坏。培养基灭菌时，必须选择既能达到灭菌目的，又能使培养基成分破坏减至最少的条件。 灭菌过程微生物死亡属于一级反应动力学类型（从对数残留定律表达式可知）。在其它条件不变时，比死亡速率?与温度的关系可用阿仑尼乌斯方程式表示。 k = A e－E/RT Arrhenius equation A — 比例常数； E — 杀死细菌所需的活化能，(DE) （×4.18 J/mol）; T