的分离纯化及结构研究方法高级生化蛋白质.ppt

　（二）蛋白被水解成肽段 要测定较大蛋白质的氨基酸序列，需要将其降解为一些肽段，经HPLC分离出各个肽段，蛋白质降解常用的是一些水解酶（如胰蛋白酶）和化学试剂（如溴化氰）。 一般都是采用两种酶（或化学试剂）解获得两组不同的肽段，以便最后拼出完整的氨基酸序列。胰蛋白酶特异地催化赖氨酸残基和精氨酸残基羧基侧的肽键的水解，而胰凝乳蛋白酶特异地催化苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸残基羧基一侧的肽键水解?????? （三）氨基酸序列测定 1950年P. Edman公布了一项新的氨基酸序列的测定技术，即运用苯异硫氰酸酯与氨基酸的反应（Edman反应）。 这种技术每次都只是从蛋白质的N端解离和鉴定一个氨基酸残基，这是一项使蛋白质序列分析革命化的技术。1967年Edman和Begg建成了多肽氨基酸序列分析仪。 二、通过核酸来演绎蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 蛋白质的氨基酸顺序是从信使RNA中核苷酸序列翻译过来的，因此必须先测出相应的mRNA顺序 二 蛋白质空间结构测定 （一）二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 ?-螺旋的CD峰有222nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而?-折叠的CD谱不很固定。 蛋白质的光学活性 Main CD features of protein 2ndary structures - band (nm) + band (nm) α-helix 222 208 192 β-sheet 216 195 β-turn 220-230 (weak) 180-190 (strong) 205 polypro II helix 190 210-230 weak Random coil 200 212 CD signal of a protein depends on its 2ndary structure —— chymotrypsin (all b) —— lysozyme (a + b) —— triosephosphate isomerase(a/b) —— myoglobin (all a) 估算蛋白质?螺旋含量 仅适合?含量较高的蛋白质！ （二）X 射线衍射法 首先将蛋白质制成晶体。但是由于糖蛋白质分子中糖基化位点和某些位点的糖链结构存在不均一性，则很难获得糖蛋白晶体。 X射线射到蛋白质晶体上，可产生不同方向的衍射。X光片则接受衍射光束，形成衍射图。这种衍射图也即X射线穿过晶体的一系列平行剖面所表示的电子密度图。然后借助计算机绘制出三维空间的电子密度图。 （三）核磁共振波谱技术（nuclear magnetic resonance,NMR） 核磁共振技术可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构， 这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态。 此外，通过改变溶液的性质，还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件，即蛋白质分子所处的各种环境，以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。，因此,NMR方法为蛋白质与蛋白质、蛋白质与底物或小分子的相互作用提供了一个有效的观察手段。 三 蛋白质空间结构预测 原因：自然的蛋白质结构和未折叠的蛋白质结构，两者之间的能量差非常小 ； 蛋白质可能的构象空间庞大，针对蛋白质折叠的计算量非常大； 计算模型中力场参数的不准确性也是一个问题。 (一)理论分析方法:该方法假设折叠后的蛋白质取能量最低的构象。根据物理化学的基本原理，从理论上(如分子力学、分子动力学）计算蛋白质分子的空间结构。但是在实际中，这种方法往往不合适 （二）统计方法：通过对已知结构的蛋白质进行统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。映射模型可以是定性的，也可以是定量的。这是进行蛋白质结构预测较为成功的一类方法。 经验性方法 结构规律提取方法 同源模型化方法 统计方法 根据一定序列形成一定结构的倾向进行结构预测。 例如，根据不同氨基酸形成特定二级结构的倾向进行结构预测。通过对已知结构的蛋白质（如蛋白质结构数据库PDB、蛋白质二级结构数据库DSSP中的蛋白质）进行统计分析，可以发现各种氨基酸形成不同二级结构的倾向，从而形成一系列关于二级结构预测的规则。 经验性方法 从