酶的定向进化2hours.ppt

8.3 　酶分子定向进化的筛选策略 与基因的定点突变不同, 在酶分子的定向进化中,突变是随机发生的, 但通过筛选特定方向的突变, 便可限定进化的趋势, 再加上适当的控制实验条件, 不仅可大大的减少工作量, 还加快了酶某种特征的进化速度。 通常, 采用的定向筛选方法必须灵敏, 且应与目的性质相关 常用方法 利用底物显色反应 改变培养条件(如逐步提高培养温度, 或改变培养基的pH 等) 利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光 高通量筛选(HTS: High Throughout Screening) , 该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选, 也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选, 酶活性筛选, 细胞活性筛选等。 HTS HTS 现有的方法有: 固相筛选、使用放射性染料筛选、荧光筛选、闪烁接近化验、LISA、利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的表型遗传学筛选等等。 高通量筛选( HTS) 体系将组合化学、基因组研究、生物信息和自动化仪器、机器人等先进技术进行了有机组合,快速 筛选得到目的物。 90 年代初期, 一个实验室采用传统的方法, 借助20 余种药物作用靶位, 一年内仅能筛选75 000个样品; 到了1997 年HTS 发展的初期, 采用100 余种靶位, 每年可筛选1 000 000个样品; 而到1999 年, 由于HTS 的进一步完善, 每天的筛选量就高达100 000种化合物, 因而, 称之为超高通量筛选。 荧光HTS 8.4 实际应用 一、提高酶分子的催化活力 这是对酶分子进行改造的最基本的愿望之一，大多实验都涉及对目的酶催化活力的提高，例如，吉林大学分于酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对L—天冬氨酸酶，等进行定向进化研究、以提高催化活力。 实例1；L—天冬氨酸酶定向进化研究 L天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马酸和氨生成L-天冬氨酸。L-天冬氨酸在医药、食品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一步证实，在这种条件下通过酶的合理化设计来进一步提高酶活力具有一定困难。为此，采用定向进化的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。 根据定向进化的基本思想，作者确定了易错PCR一筛选一(优势突变重组一筛选)n的实验路线。共进行了4轮易错PCR，每一轮易错PCR约筛选了3000个菌落。最终得到了一株酶活力提高28倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产L—天冬氨酸。 进化酶基因测序结果表明共发生了7个碱基突变，其中3个点突变引起了氨基酸的改变：Asn217Lys，Thr233Arg，Val367Gly。Thr位于亚基间相互作用的界面上，距离Lys3271．5nm以内，推测突变后的Arg与底物α—COOH的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体．从而引起了进化酶K m的下降和Kcat值的提高。L—天冬氨酸酶活性位点的重要催化残基没有改变，暗示该进化酶的催化机理与天然酶相同。 二、提高酶分子稳定性的定向进化 一般单氨基酸残基突变造成酶的熔化温度(Tm)的升高为1—2℃，而更多的提高比较罕见。例如已经确定的T4溶茵酶11个不同的单点突变株将酶Tm提高的范围是0．8一1．4℃；已发现的8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了o．7—4．2℃，而另一个氨基酸取代可能因为填充了蛋白质分子内部的一个空穴而导致Tm产生了7．8℃的提高。 三、适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化 利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速率．而天然酿在有机溶剂中，即使有时能保持天然构象也极易失活．因此在这种酶分子的应用环境中对配分子定向进化就十分必要。例如枯草杆菌蛋白酶在60％DMF中的定向进化，提高了酶的活力和稳定性。最近利用定向进化和基因重组，创造了对硝基苄基酯酶在DMF中使合成抗生素中间体脱保护，在30％DMF中配活力提高了100倍。 天然酶在生物体内不会接触到人工添加的去离子螯合剂，而酶在应用于洗涤剂工业中的时候．就必须在螯合剂存在的环境中保持活力，因此有必要改变大多数应用的蛋白酶依赖金属离子来保持其活力或稳定性的性质。Bryant及其同事进化了一株在缺少Ca2+ ，仍稳定的枯草杆菌蛋白酶。他们随机突变了10个氨基酸残基，删除了结合Ca2+的凸环。在无Ca2+的溶液中进化酶半衰期比野生型长12．5倍。后来的几轮突变与筛选又产了7株更加稳定的不依赖于Ca2+的进化酶。 四、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化 增加底物专一性，可以使酶更加适应工业化生产。 Gulick实验进化了谷胱甘肽转移酶，使