实验七和八提质粒,酶切,pcr2009.pptVIP

实验七　质粒DNA的提取　　与酶切  质粒： 　　　质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1一2OOkb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。 质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也可对宿主细胞的相应缺陷进行补偿。 本实验分离纯化的质粒为插入一个外源基因到pET9a 的pETC质粒, 大约有 4341+650 碱基对(bp). 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤: 1.培养细菌使质粒扩增; 2.收集和裂解细菌; 3.分离和纯化质粒DNA。 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤 1.培养细菌使质粒扩增; 2.收集和裂解细菌; 3.分离和纯化质粒DNA。 大肠杆菌质粒DNA的分离及纯化（碱变性法） 试剂配方： 1. Solution I (GET): 5O mmol/L 葡萄糖， lO mmoI/L EDTA-Na2( pH8.0) 25 mmol/L Tris-HCl ( pH8.0) 2. Solution II（新鲜配制） 0.2mol/L NaOH 1% SDS 3. Solution III 60ml 5mol/L KAc 11.5ml HAc 28.5ml dH2O 最终: [Ac-]=5mol/L [K+]=3mol/L pH～4.8－5.2 4. TE buffer(pH8.0) 10mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 1mmol/L EDTA-Na2 (pH8.0) RNase A 10mg/ml in dH2O 7mol/L NH4Ac 异丙醇， 无水乙醇, 70%乙醇 (-20 ℃保存) 大肠杆菌质粒DNA的分离及纯化（碱变性法） Protocol 1.养菌扩增质粒：于LB液体培养基（内含相应的抗生素）中接种 单菌落，37℃振荡培养过夜； 2.收菌：吸取菌液于Ep管中，12500rpm离心30 sec，弃尽上清； 3.除RNA： 加入4℃预冷的 Solution I 100ul，充分悬浮菌体，同时加入RNase (10mg/ml) 3 ul, gentle混匀， 室温5--10min； 4.溶菌： 加入200ul新配的Solution II，轻轻颠倒数次充分混 匀，冰浴5--10min至变清亮； 5.沉淀蛋白及染色体DNA：加入4℃预冷的 Solution III 150ul，反复颠倒充分混匀，冰浴10min； 6.获取质粒溶液：12500rpm离心5-7min，上清移至新Epp管中； 7.去除残留蛋白：加入200ul苯酚/氯仿/异戊醇 (25：24：1)， 振荡混匀，12500rpm离心5min, 回收上层水相至新Epp管中； 8.除去残留酚：加入200ul氯仿/异戊醇 (24：1)，振荡混匀，12500rpm离心5min， 回收上层水相至新管中； 9.收获质粒DNA：加入1/10体积3M NaAc (pH5.2), 2--2.5倍体积冰无水乙醇，混匀，-20℃10min； 10.洗去多于盐分：12500rpm离心15min，弃上清；用400 ul 70%冰乙醇洗涤沉淀，12500rpm离心3min，弃尽上清； 11.制备质粒溶液：?室温或37℃温箱干燥后，用30 ul ddH2O/TE (灭菌)溶解沉淀，4℃保存备用。 离心机的正确使用： 平衡