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第三章 灭活剂、保护剂与免疫佐剂 2007-11-25 第一节 灭活剂 一、灭活与灭活剂 兽医生物制品生产中，灭活（inactivation）是指破坏微生物的生物学活性、繁殖能力和致病性，但尽可能不影响其免疫原性。被灭活的微生物主要用于生产灭活疫苗；或指破坏诊断血清或待检血清中的补体活性，以避免补体对诊断试验的干扰作用。灭活的对象不同，采用的方法也不尽相同。 本节 主要讲解微生物的灭活方法及其作用机理。 研制灭活生物制品，选择合适的灭活剂和灭活方法十分重要。 灭活的主要方法有两类，即物理学方法和化学方法。 1.物理学灭活方法： 有加热及射线照射等方法，过去用加热灭活方法者较多。该法简单易行，但加热杀死微生物的方法比较粗糙，容易造成菌体蛋白质变性，因而免疫原性受到明显影响，所以，该灭活方法已基本不用。 射线照射则主要通过破坏核酸来达到灭活微生物体的目的，而微生物的蛋白质、脂类和多糖等有机化合物的一般不受影响。因此，射线照射不破坏微生物的免疫原性，如60Co照射处理后的血清或裂解红细胞全血的质量没有发生变化，经测定17种氨基酸含量与非照射的血清无差异。 60Co照射(rad拉德 ) 应用时应根据被照射物的容量大小选择照射物与钴源的距离和剂量。 用60L大玻瓶装6L的血清或血液，吸收60Co量200万rad/h能完全杀死芽孢杆菌， 150万rad/hr可使非芽孢菌完全灭活。 含鸡新城疫病毒的鸡胚尿囊液，吸收60Co剂量达50万rad/h，病毒可完全被灭活。 猪瘟病毒强毒吸收量达到300万rad/h完全失去致病力。 被60Co照射处理的血清用于细胞培养，与未照射的血清比较，病毒培养效果一致；被照射处理的裂解全血，不影响牛出败菌及禽霍乱菌的生长，制出的菌苗免疫效力良好。 2.化学灭活方法： 用于灭活微生物的化学试剂或药物称为灭活剂（inactivator）。 化学灭活剂的种类很多，作用的机理也不同，而且灭活的效果受多种因素影响。 （一） 甲醛溶液 甲醛是最古典的灭活剂，至今仍是生物制品研究与制造中最主要的灭活剂。我国农业部发布的《兽医生物制品制造及检验规程》（2000）中的26种灭活疫苗，均以甲醛作为灭活剂。 甲醛溶液是甲醛气体的水溶液，又称福尔马林。常用的甲醛溶液约含37％甲醛气体（重量计），为无色透明液体，有辛辣窒息味，对眼、鼻粘膜有强烈刺激性，较冷温度下久贮易变混浊，形成三聚甲醛沉淀，虽加热可变清，但会降低其灭活性能，故一般商品甲醛溶液加10％～15％甲醇，以防止其聚合。 甲醛的灭活作用机理 是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质的氨基产生羟甲基胺，作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟基甲酚，作用于巯基形成亚甲基二醇。 上述反应生成的羟甲基等代替敏感的氢原子，破坏生命的基本结构，导致微生物死亡。 甲醛还可与微生物核糖体中的氨基结合，使两个亚单位间形成交联链，亦可抑制微生物的蛋白质合成。 近年发现，对病毒和细菌等的核酸的烷化作用比对蛋白质的作用更有利杀灭微生物。 灭活剂甲醛的浓度及处理时间 适当浓度的甲醛可使微生物丧失增殖力或毒性，保持抗原性和免疫原性。 针对不同类型的微生物，使用甲醛灭活的浓度一般为：需氧细菌0.1％～0.2％，厌氧菌0.4％～0.5％。病毒0.05％～0.4％（多数为0.1％～0.3％）。 不论是杀菌或脱毒，使用甲醛或其他灭活剂，灭活剂的浓度及处理时间都要根据试验结果来确定。 通常以用低浓度、处理时间短而又能达到彻底灭活目的为原则，必要时可在灭活后加入硫代硫酸钠，以中断其反应。 灭活疫苗/甲醛浓度/时间/温度 气肿疽明矾 0.5%甲醛 37~38℃ 72~96h 气肿疽甲醛 0.5%甲醛 37~38 ℃ 72~96h 肉毒梭菌(C型) 0.8%甲醛 37℃ 10d 羊快疫-猝疽-肠毒血症三联 0.5%-0.8%甲醛 37~38℃ 3~7d 家兔魏氏梭菌氢氧化铝 0.8%甲醛 36-37℃ 5d 羊大肠杆菌病 0.3%甲醛 37℃ 24~48h 猪丹毒、猪肺疫氧氧化铝二联　0.25%甲醛 37℃ l8~24h 猪丹毒氢氧化铝灭活疫苗 0.2%~0.25%甲醛　37℃ 18~24h 牛出血性败血病氢氧化铝 0.l%~0.2%甲醛 37℃ 7~18h 猪肺疫氢氧化铝灭活疫苗 0.1%甲醛 37℃7~12h 灭活疫苗/甲醛浓度/时