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实验一 硅胶 G 薄层层析 薄层层析是在吸附色谱基础上发展起来的一种快速微量操作简便的层析法。硅胶是薄层 层析中应用最广的吸附剂，由于硅胶薄层的机械性能差，一般必须加入 10％～15％的煅石 膏作为粘合剂，称为硅胶 G 。展层剂凭借毛细管效应在薄层中移动，点在薄层上的样品随展 层剂的移动而不同程度的移动。因为被分离物质的极性有差异，因而与吸附剂和展开剂的亲 和力有差别，结果在薄层板上的迁移率 Rf 值不同，对于某一物质，在一定的溶剂系统和一 定的温度下，Rf 值是该物质的特征常数，被分离物质 Rf 值差别越大，分离效果越好。可选 择适当的展开剂扩大被分离物质的 Rf 值差别，以期达到较理想的分离效果。 第一部分 可溶性糖的薄层分离与鉴定 一、原理 糖是多羟基化合物，在硅胶 G 薄层上展层时，被吸附的强弱有差别，其吸附力主要与 糖分子中所含有羟基数目有关。吸附力大小顺序为：三糖二糖 己糖戊糖。展层后，喷显 色剂显色，不同的糖呈现不同的颜色，吸附力越大的糖 Rf 值越小，与已知标准糖的颜色和 Rf 值比较，即可鉴别样品提取液中糖的种类和含量，显色后进行拍照或扫描定量。 二、材料、仪器和试剂 1． 材料 苹果或其他植物材料 2 ． 仪器 ① 离心机及大离心管 ② 涂布器 ③ 天平 ④ 烘箱 ⑤ 研钵 ⑥ 微量点样器或毛细管 ⑦ 层析缸 ⑧ 吹风机、喷雾器 ⑨ 电热水浴 ⑩ 蒸发皿、量筒（50ml ）、刻度吸管、玻璃板（15×7cm ） 3 ． 试剂 ① 95 ％乙醇和80 ％乙醇 ② 硅胶 G 和 0.1mol ∕L 硼酸 ③ 氯仿 ④ 冰乙酸 ⑤ 1 ％标准糖溶液（10mg ∕ml ）:木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖 ⑥ 苯胺－二苯胺－磷酸显色剂：称取 2.0g 二苯胺于烧杯中，加入 2ml 苯胺溶液 溶解后、再加 10ml 85％磷酸，边加边搅然后用 100ml 丙酮溶解混匀 四．操作步骤 1．硅胶 G 薄板的制备 制板用的玻璃板应平整光滑，预先用洗液或其他洗涤剂洗净，干燥后备用。称取硅胶 G 粉 3.5g，加 0.1mol ∕L 硼酸溶液 9ml，于研钵中充分研磨，待硅胶由稀变稠、发出如脂 肪光泽时，倾入涂布器中均匀涂布在玻璃板上，可铺 7 ×15cm 薄板 1 块。铺布后的薄板 置于 100℃烘箱中烘干，取出后放在干燥器中备用。也可在温室下自然干燥 24h ，用前放 入 110℃烘箱中活化 30 分钟。 2 ．样品提取液的制备 称取果肉（或其他植物材料）5g，放于研钵中研成匀浆，加 10ml95％乙醇继续研磨5 分钟倒入离心管，离心（3000r ∕min ）10 分钟，吸取上清液作为点样液。 3 ．点样 取活化过的硅胶 G 薄板，在距底边 2cm 水平线上确定 5 个点，相互间隔约 1cm，其 中4 个点分别点上木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖标准液，另一个点点样品液，点样量分别为 2ul ，然后用吹风机吹点样原点，使其刚消失为止。如果继续吹，可能在层析后出现拖尾 现象。 4 ．展层 本实验选用氯仿：冰醋酸：水＝18：21 ：3 或者选用乙酸乙酯：异丙醇：水：吡啶=26 ： 14：7 ：5 为展层剂，用前临时配制（只能用一次）。展层在密闭器皿中进行。为了消除边 缘效应，可在层析缸内壁贴上浸透展层剂的滤纸条，以加速缸内蒸汽的饱和。将薄板点有 样品的一端进入展层剂，注意切勿使样品原点浸入溶剂，盖好层析缸盖，上行展层。当展 层剂前沿离薄板顶端 1～2cm 时，即可停止展层，取出用吹风机吹干。 5 ．显色 显色是鉴定物质的重要步骤。本实验采用苯胺－二苯胺－磷酸显色剂丙酮溶液喷雾 法，喷出细雾使薄板均匀湿润，然后于 100℃烘箱中烘烤 12 分钟，各糖即出现不同的颜 色。 五．结果计算 小心量出原点至溶剂前沿和各色斑中心点的距离，计算出它们的 Rf 值。根据标准糖 的颜色和R 值，鉴定出样品提取液中糖的种类，并绘出层析图谱。 f 原点至色斑中