12第六章 细胞培养.pptVIP

* * 第六章 细胞培养 一.单细胞的分离 细胞培养:指将植物单细胞或细胞团直接在培养基中进 行培养的一系列培养方式. 特点:操作简单,重复性好,群体大 应用：筛选突变体，遗传转化，生产次生代谢物 (一) 由植物器官分离单细胞 1.机械法 (叶片) (1)研钵中加入10g叶片+40ml研磨介质 蔗糖 20 μmol/L MgCl210mμol/L Tris-HCl缓冲液20μmol/L PH7.8 (2)两层细纱布过滤 (3)中低速离心,净化细胞 例:石刁柏植物叶片细胞的分离 (1)叶片消毒,切1cm2小块 (2)10ml培养基+1.5g叶片-?匀浆 (3)无菌过滤器过滤 (4)低速离心.弃去上清液-?细胞悬浮于培养中 机械法分离细胞的优点 不受酶的伤害作用 无需质壁分离 产量低 2.酶解法 a. 60～80日龄植株上切取幼嫩的完全展开叶,表 面消毒,无菌水冲洗 机械法分离细胞的缺点 b.镊子撕去下表皮,解剖刀将叶片切成4cm×4cm小块. c.取2g碎叶片置于装有20ml无菌酶溶液组成的三角瓶中 酶溶液组成 0.5%离析酶 0.8%甘露醇 1%硫酸葡聚糖钾 d.真空泵抽气,使酶渗透入叶片组织 e.三角瓶置于往复式摇床,120r/min,25 0C, 2h.其间每隔 30min更换酶溶液1次. 第一个30min的酶溶液弃掉 第2个30min后的酶溶液含有海绵薄壁细胞 第3个和第4个30min后的酶溶液含栅栏组织 f.用培养基将分离得到的单细胞洗涤2次后即可培养. (二).由愈伤组织分离单细胞 方法:1.将未分化、易散碎的愈伤组织转移到装有适当液 体培养基的三角瓶中,将三角瓶置于摇床上以80～ 100r/min进行振荡培养,获得悬浮培养液. 2.用孔径约200微米的无菌网筛过滤,以除去大 块细胞团;再以4000r/min速度离心,以除去比单 细胞小的残渣碎片,获得纯净的细胞悬浮液. 3.用孔径60～100微米的无菌网筛过滤细胞悬浮液, 再用孔径20～30微米的无菌网筛过滤;将滤液进 行离心,除去细胞碎片. 4.回收获得的单细胞,用液体培养基洗涤,即可用于 培养. 二.单细胞培养 (一).单细胞培养方法 1.平板培养法:是将制备好的单细胞,按照一定的细 胞密度,接种在约1mm厚固体培养基上进行培养的 方法. 常用方法: (1)将单细胞悬浮液进行细胞记数后,离心收集已知数 目的单细胞; (2)用培养单细胞的培养基将细胞密度调至最终培养时的 植板密度的两倍. (3)将与上述液体培养基成分相同但加入0.6%～1%琼脂的 培养基加热,使琼脂融化,然后冷却至350C.置350C恒温水 浴中保温. (4).将这种培养基与上述细胞悬浮培养液等体积混合 均匀.迅速注入并使之平展于培养皿中(约1mm厚).封口. (5).将培养皿置于显微镜下观察.标记各单个细胞.一般 分离出纯单细胞无性系.培养. 植板效率=形成的细胞团数/植板的细胞总数×100% 最适密度 临界密度 几个相关概念： 2.看护培养法 利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞 或者异种愈伤组织等方法. 3.微室培养法 是指人工制造一个微室,将单细胞培养在微室中的少 量培养基中,使其分裂增殖形成细胞团的方法. 优点:在培养过程中可以连续进行观察,将1个细胞的生长 、分裂和形成细胞团的全部过程记录下来. 4.纸桥培养法 (二)影响单细胞培养的因素 培养基的成分（KM8P） 细胞植板密度(104～105细胞/ml) 原理:细胞可合成分裂所需物质,当此物质 达到一定浓度(临界值)细胞才能分裂. 故 密度高 达到平衡快(早) 细胞分裂快 密度低 慢 慢 三.细胞悬浮培养 是指游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮 在液体培养基中进行培养的方法。 特点:提高同步化分裂、增殖速度。可用于大规模生产。 CO2也对诱导细胞分裂有重要意义 (一).培养方法 1.分批培养:是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的 液体培养基中进行培养. 意义:建立单细胞培养物 (1) 容器:100～250ml三角瓶 20～75ml培养基密闭 (2) 细胞增长数目 S形曲线 滞后期 对数生长期 直线期 减缓期 静止期 a.滞后期的长短 取决于 细胞生长状态 转入的细胞数目 b.缩短继代培养时间间隔(2～3天继代一次),则可始终 保持对数生长. c.提高细胞的分散度 继代培养时,只取单个或小细胞团. 2.连续培养:用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种 方法