国家精品课程基因工程课件chapter10.pdf

第十章基因转移技术 概述 • 运用物理、化学或生物学的方法和技术将 外源基因转移到受体细菌或者细胞内，并 使之在细菌或细胞内实现转入基因的扩增 好表达称为基因转移技术。它是重组DNA 技术和基因治疗的关键步骤之一。 • 分为： 1. 基因转移的物理学方法 2. 基因转移的化学方法 3. 基因转移的生物学方法 第一节、基因转移的物理学方法 • 利用物理学原理，导致细胞膜发生暂 时性的变化，从而使外源基因进入细 胞内的方法。 • 主要有 1. 显微注射法 2. 电穿孔法 3. 基因枪法 一、显微注射法(Microinjection) • 受体细胞主要是卵细 胞，现在也用于贴壁 细胞 • 成功率与操作者的熟 练程度有关 • 主要用于转基因动物 二、电穿孔法(Electroporation) • 在高压电场的瞬时作用下，细 胞膜可以出现可逆的微小孔 洞，外源DNA 可以通过这些 孔洞进入细胞内。 • 可用于真核、原核细胞的转染 • 优点：简单、重复性好、转移 效率高 • 缺点：对细胞有损伤 三、基因枪法(gene gun) •又称微抛物法或颗粒加速 法(biolistics) 第二节、化学转染法 • 利用化学物质对细胞或DNA 分子进行处理 和修饰，以使外源性DNA顺利进入细胞内 的方法。 1. 氯化钙转移法 收集对数生长期的E. coli ，用冰预冷的CaCl 处 2 理后，使之成为感受态的细胞(competent state) 取一定量的细菌，加入适量的感受态的细胞， 冰浴后，42°C 热休克90秒，快速冷却后，加适 量LB培养基，37°C 孵育1小时使细菌复苏，图 板培养。 2. DNA-磷酸钙共沉淀法 先将DNA 分子溶解到氯化钙溶液中，再缓慢滴 加含磷酸的HEPES溶液，形成细小的DNA-磷酸 钙共沉淀颗粒。小心地将这些颗粒吸出加入到 培养的靶细胞表面，保温数小时后，DNA会被 靶细胞吞噬。更换培养基以使外源性基因在靶 细胞中表达，再筛选转化阳性的细胞。 用途：外源基因的短暂表达及建立稳定的细胞系 缺点：转染效率低，约为10-3-10-6 。 3. 脂质体转染法(liposome) 是一种人工膜。在水中磷脂分子亲水头部插入水中， 疏水尾部伸向空气，搅动后形成双层脂分子的球形脂 质体，直径25～1000nm不等。 脂质体可用于转基 因，或制备的药物， 利用脂质体可以和细 胞膜融合的特点，将 药物送入细胞内部。 • 在有聚乙二醇(PEG)和植物凝集素存在的情 况下，靶细胞与载有外源DNA 的脂质体融 合，通过胞吞作用将脂质体摄入细胞内。