上课血红蛋白的提取和分离剖析.ppt

（3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功） （三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做） 鉴定血红蛋白纯度。 1.目的： 1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？ 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。 三、结果分析与评价 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？ 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？ 由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。 3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？ 蛋白质分离的原理： 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。 一、基础知识 凝胶色谱法（分配色谱法） 1、概念：根据被分离物质（如蛋白质）相对分子质量的大小，利用具有多孔网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。 性质：微小的多孔球体 本质：多糖类化合物 实例：葡聚糖、琼脂糖 提取分离方法 凝胶色谱法 凝胶电泳法 凝胶色谱法分离蛋白质 相对 分子质量 大 小 直径大小 大于凝胶颗粒孔道直径 小于凝胶颗粒孔道直径 运动路径 被阻挡在凝胶颗粒外面而迅速通过 因扩散进入凝胶颗粒内部而被滞留 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先 后 2、凝胶色谱法的原理 （二）缓冲溶液 能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。 1、作用: 2、缓冲溶液的配制: 通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。 （二）缓冲溶液 3、 在本课题中使用的缓冲液是： 磷酸缓冲液 成分：NaH2PO4 /Na2HPO4 （三） 电泳： 1、概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2、原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 3、类型: 琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺（形成交联） 丙烯酰胺和交联剂 N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应