造血细胞分离、集落培养与表型分析.pdfVIP

一、摘要 造血干细胞(Stemcell,SC)，是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种 血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分 化成其他细胞。传统的造血干细胞采用集落分析法进行鉴别，通过在半固体培养基上培养 10~14 天 ， 在 显 微 镜 下 计 数 粒 - 巨 噬 细 胞 集 落 形 成 单 位 colony-forming unit-granulocyte/macrophage,CFU-GM，即可知样品血液中所含有的造血干细胞的百分数，通 过使用流式细胞仪来分析并与集落分析进行比较，可以更加准确地获知造血干细胞的百分 数。 本实验通过对人类新鲜脐带血中造血细胞的分离、集落培养、计数等过程，进一步了解 造血细胞，区别其与其他无自我更新能力和多向分化能力的细胞的不同之处，并掌握造血细 胞的一般分离过程，初步介绍了流式细胞仪的实验原理和基本操作方式，并求出全血中造血 干细胞的收率。 二、实验原理 2.1 造血干细胞的采集 造血干细胞主要存在于骨髓、动员的外周血、脐血中，与骨髓和动员的外周血相比，脐 血来源丰富、受病毒污染的几率小、富含造血干细胞且所含的造血干细胞具有更高的增值潜 能，同时脐血中的淋巴细胞幼稚，具有较低的免疫排斥活性，是优良的造血干细胞来源。 2.2 造血干细胞的标志 + - - 造血干细胞的表面标志随个体发育的不同时期而发生变化，CD34 、CD38 、HLA-DR 、 + + - - - - Thy-1 、c-kit 、LFA-1、CD45RA 、CD71 、lin 已普遍被认为是造血干细胞的标志。此外， 1997 年发现的一个新标志是AC133，但CD34 抗原是目前公认的造血干细胞和祖细胞的共 同标志。CD34+细胞成功诱导为血管内皮细胞，并在动物体内能生成血管恢复坏死处血运， + 由此说明该抗原是血管内皮祖细胞的一个重要标志。CD34 分子是高度糖基化的i 型跨膜糖 蛋白，选择性地表达于人类及其他哺乳动物造血干／祖细胞表面，并随细胞的成熟逐渐减弱 + 至消失。CD34 分子在介导细胞间黏附作用中发挥着重要作用，可参与造血干细胞的运输、 定植，参与炎症反应以及淋巴细胞的归巢。 2.3 单个核细胞的分离 将稀释过的血浆进行离心操作后，由于不同的血细胞沉降速率与所采用的离心力成比 例，并受到血液的物理性质影响，在一个固定的离心力和液体粘度下，血细胞的沉降速率伴 随细胞颗粒大小及其自身密度与周围介质密度之间的差别成比例。采用密度梯度原理，利用 血液中各类细胞的密度不同，从而实现初步分离。 2.4 造血干细胞的检测方法 2.4.1 集落检测 利用造血干细胞的特性，在特定的条件下，造血干细胞可向某一系的细胞分化，从而在 半固体培养基上形成一个个的克隆，即集落，一个集落代表一个造血干／祖细胞。 传统方法是在半固体培养基上培养十余天，随后在显微镜下计数集落，以含50 个细胞 + 以上的细胞团为一个集落。CD34 细胞在体外分离和培养过程通常用24 孔板进行。 2.4.2 流式细胞仪分析法 待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动 下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被 鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着 一种分鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来， 进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区成为测量区。利用样品流和鞘流的气压 差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染 料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散 射光信号，同时被荧光光电倍增管接受，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、 通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分 析。 三、实验材料 3.1 实验仪器 移液枪(10ml,1000ul,200ul,10ul