用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响.docVIP

实验报告 课程名称：生物化学实验（甲） 指导老师： 成绩：__________________ 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填） 五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得 用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响 实验目的和要求： 1. 初步掌握正交试验设计法的使用； 2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。 实验内容和原理： 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、 pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。 本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。 正交表 Ln（ tq） L —— 正交表的代号 n —— 处理数（试验次数） t —— 水平数 q —— 因素数 合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。 本实验中： 试验次数 n = q( t–1 )+1= 4（3－1）+1＝9 总自由度 V总= n-1 各列自由度 V列 = K（该列水平数）–1 本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为： V1 = 3–1 = 2， V2 = 3–1 = 2， V3 = 3–1 = 2， V4 = 3–1 = 2。 四个因素的自由度总和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8 因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 9–1 = 8。所以选择正交表L9（34）是适合的。 正交表都应具有以下两个特性： （1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。 （2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。 实验材料与试剂： 1、实验材料 蔗糖酶溶液（样品Ⅳ1:10稀释） 2、实验试剂 ⑴ 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； ⑵ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6； ⑶ 3,5－二硝基水杨酸试剂。 实验器材与仪器： 1. 试管及试管架； 2. 吸量管； 3. 恒温水浴箱 （37℃、50℃、65℃、100℃ ）； 4．可见光分光光度计。 操作方法和实验步骤： 1、实验设计 （1）确定试验因素和水平 本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因 素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。 表1 因素、水平表 水平 因素 【S】 （ml） 【E】 （ml） 温度 （℃） pH 1 0.5 1.0 50 3.6 2 0.2 0.6 37 5.6 3 0.8 0.2 65 4.6 选择合适的正交表 在所选的正交表上进行表头设计 表2 表头设计 实验号 水平 因素 1 【S】 2 【E】 3 温度 4 pH 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 试验安排 表3 实验安排表 试剂 试验号 2 4 9 1 6 8 3 5 7 5%蔗糖溶液（ml） 0.5 0.2 0.8 0.5 0.2 0.8 0.5 0.2 0.8 0.2mol/L乙酸缓冲液 （ml） pH5.6 1.0 pH4.6 1.0 pH3.6 1.0 pH5.6 1.0 pH4.6 1.0 pH3.6 1.0 pH5.6 1.0 pH4.6 1.0 pH3.6 1.0