酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆和表达.pdfVIP

No．1 第39卷第1期 工业微生物 Vd．39 2009年2月 Industrial Feb．2009 Microbiology 酿酒酵母乙醛脱氢酶的克隆与表达 黄瑞1， 王璐1， 沈微1， 张晓梅2，许赣荣¨ (1．江南大学生物工程学院，江苏无锡，214122；2．江南大学医药学院，江苏元锡，214122) cerevisiae 摘要 利用PCR技术从酿酒酵母(SaccharomycesW303。1A)总DNA中扩增得到 体在大肠杆茵JMl09中得到高效表达。对含有aMh的基因工程茵进行表达研究表明：该茵株在 37℃下，以1．0mmol／L 检测不到酶活力，并且该茵的耐乙醛浓度可达3．29／L。 关键词：乙醛脱氢酶； 酿酒酵母；克隆与表达 acid，简称3．丙醛(3．m)A)脱氢后生成3一羟基丙酸，本研究对进 3一羟基丙酸(3-hydrtrcypropionic 肿)，又名p一羟基丙酸，是一种较为活泼的化学物 一步构建利用甘油产3一羟基丙酸(3．船)的基因工 质，工业上可以用来合成很多重要的化工产品，还可 程菌打下了基础。 以用于生产涂料、胶黏剂、水处理化学品和个人护理 1材料与方法 用品，在商业上具有重大的开发价值…。目前，3． }母的生产方法主要是化学合成法，如p，溴丙酸水 1．1菌株和质粒 解法、2．氰基乙醇酸碱法、3一羟基丙醛氧化法等，这 大肠杆菌(Escherichiacoli)J硼09、酿酒酵母( cerevisiae W303—1A)，由本实验室保 些化学合成法生产3．唧的难度较大，且产品分离 Saccharomyces 纯化较复杂，生产成本较高。用微生物发酵法和化 藏，质粒载体pEtac【10]由江南大学沈微博士构建。 cerevisiae W303—1A) 学法相比，具有成本低、操作简单、条件温和、副产物 酿酒酵母(Saccharomyces 少、绿色环保等优点。目前尚未发现直接利用糖或 在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其 其他有机原料产3一羟基丙酸的微生物。利用基因 作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。该菌的核苷 工程手段构建以甘油为底物发酵产3一羟基丙酸的 酸第303831 基因工程菌涉及到两个关键酶，即甘油脱水酶和乙 )基因序列，全长1954bp。 醛脱氢酶，首先在甘油脱水酶作用下，甘油脱水转化 1．2培养基 成3．羟基丙醛(3．卜Ⅱ)A)，然后在乙醛脱氢酶的氧化 酿酒酵母种子液YPD培养基(∥L)：葡萄糖 作用下生成3．羟基丙酸(3一HP)，甘油脱水酶的研究 20，蛋白胨20，酵母提取物10，pH5．5，固体培养基 已见文献报道【2叫]，而来源于酿酒酵母的乙醛脱氢 含209／L的琼脂。 酶(AIDH)克隆与表达尚未见国内文献报道，国内 大肠杆菌LB培养基(g／L)：蛋白胨10，酵母膏 有文献报道草羊、华支睾吸虫乙醛脱氢酶克隆与表 5，氯化钠10，固体培养基含209／L的琼