实验三(设计性实验)九龙江水大肠菌群的测定.docVIP

九龙江水大肠菌群的测定 周涛 （闽南师范大学生科院食品科学与工程14级） 摘要：本文通过多管发酵法测定水源水大肠菌群数量，初步发酵试验检测水源水存在大肠杆菌菌群，平板分离得到单一菌群群落，复发酵试验通过革兰氏染色确定为大肠菌群阳性结果。 关键词：九龙江水、大肠菌群、多管发酵法、初步发酵试验、平板分离、复发酵试验、革兰氏染色、 DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA JIULONG RIVER WATER Tao Zhou Abstract: In this paper, multiple tube fermentation method determined by the number of coliform source water, preliminary fermentation tests detect the presence of E. coli bacteria source water, flat flora isolated single community, complex fermentation test by Gram stain identified as coliform positive results. Key words: Jiulong River water, coliform, multi-tube fermentation method, preliminary fermentation tests, flat separated, complex fermentation test, Gram stain, 材料与方法 1.1 基本原理 多管发酵法包括初步发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。 1.1.1初步发酵试验(48h ，需2天) 发酵管内装有乳糖胆盐蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小导管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产生酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还有抑制其它细菌如芽孢菌生长的作用。 水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h 内小套管中有气泡形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h 后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h 后仍不产气的为阴性结果。 1.1.2平板分离（1天，初发酵2天后做此实验，此实验第2天即可做革染） 平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂（远藤氏培养基）或伊红美蓝琼脂（EMB agar）,前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群落变成为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可以抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红美蓝染料，在此作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的铜绿色深紫色（龙胆紫的紫色）菌落。初发酵管24h 内产酸产气（阳性结果）和48h 产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。 1.1.3复发酵试验 以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性芽孢杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h 培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。 1.2实验材料和设备： 器材： 试管、吸头（1ml、5ml）、冰箱、量筒、玻棒、烧杯、PH计、培养皿、水浴锅（箱）、培养箱、试剂瓶、电磁炉、显微镜、锥形瓶、接种环、干燥箱、汉德氏管、高压灭菌器、单道移液器、电子分析天平、培养基：乳糖胆盐蛋白胨、伊红美蓝琼脂（EMB） 1.3操作步骤 （一）多管发酵（大肠菌群的测定） 1.3.1水样的采集： 用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。 1.3.2水样的稀释： 将灭菌的三根试管各装9ml的无菌水标上1、2、3各组的记号。充分振荡水样，从中吸取1ml于1号试管中，充分振荡即得1：1 0的稀释液。同理配制1：100及1：1000稀释液。 1.3.3水源水的检查 （1）从原水样、1:10、1:100、1：1000的稀释液各吸取1ml于4支经过灭菌的装有10m乳糖胆盐蛋白胨液体培养基中，内倒