全细胞记录模式影响肥大细胞分泌机制.pdf

维普资讯 第 23卷 第 u 嘏 华 中 理 工 大 学 学 报 Vo1．23 No．11 V 曹思升 康华光 邹寿彬 7 (自动控 制I程 亲) 广r抽 蔓 利用细胞膜电容监测技术和显微镜形态观察的方法．研究了全细胞记录模式对肥大细 胞分泌反应的影响．结果表明，机械力与电场力对细胞分泌反应有一定的抑制作用，胞浆 内离子 和活性4、分子的冲洗流失贝II是影响分泌反应的根本原因．最后提出了全细胞记录模式对腮大细 胞分泌反应的作用机制． 关■调 膜片钳j全细胞记录}器大细胞}分泌 分娄号 Q 27 自从膜片钳技术应用到细胞分 泌机制的研究上 以来，已取得了大量的成果 ]．但是 t同全 细胞离子电流记录时遇到的问题一样 ，细胞内各种游离的小分子以及离子受到电极内液的冲 洗并流失到电极内液中的现象较为严重．为 r克服这一不 良因素的影响，国内外有关的实验室 进行了大量的研究，但由于生理反应的复杂性 ，使得这一问题始终未能得到全面 、彻底的解决 有的实验只好放弃标准全细胞记录的优越性 ．采用穿孔膜片钳 (PeHoratedPatchClamp){。 术0抑制胞内物质的流失．然而，由于穿孔膜片钳存在不能控制细胞内成分和串联电阻较大 “ 局限，使得人们不得不进一步地研究标准全细胞记录时的影响因素 ，以便获得准确的实验结 果 本项 目研究了全细胞记录对肥大细胞分泌的影响，分析了全细胞记录模式对肥大细胞分泌 反应的作用机制，为改进实验技术和分析实验结果提供了有力的依据． 1 材料与方法 1．1 肥大细胞摄取方法 国内外常用的提取、纯化方法是梯度离心法0 ．这种方法虽然能够得到纯度较高 (99 ) 的肥大细胞，但 由于它必须使用较好的离心机和加入、去除调 比重 的化学试剂 ．使实验戚本较 高 操作较繁琐、细胞易受损伤而活性变整 ．为解决此问题 ，摸索出下述改进方法 (可称为盖玻 片沉降移植法)．用这种改进的方法提取肥大细胞不仅操作简单 、速度快 ．而且细胞的活性也较 好．肥大细胞的纯度为 70 左右，足以满足膜片钳实验的需要． 成年 Wistar大 鼠麻醉断头 ，剪开腹部皮肤．用蒂罗德 (Tyrode)液冲洗腹腔，抽取腹腔 液，注入预先放有盖玻片的培养皿中，沉降冲洗腹腔液数次并将盖玻片移植到另一培养皿 中以 获取表面清洁、密度适中、活性 良好的肥大细胞．置于 37℃ 恒温箱中，通 5 CO +95 O混 收稿 日期t1993-10-18． 曹忠升，勇，1865年生，博士}武汉 ，华中理工大学 自动控制工程系 (430074) * 国家教委博士点基金资助项 目 (8948715) ． 维普资讯 第 ll期 曹忠丹等 ；全细胞记录模式影响肥大细胞分泌的机倒 台气体，温孵 0．5～l0h(用棒度离心法得到的细胞一般只能温孵 6h)． 1．2 记曩方法 利用膜片钳技术对肥大细胞进行全细胞记录．采用频域法 对细胞膜电容进行动态监视． 由于细胞膜 电容正 比于细胞膜表面积，而分泌活性的强弱与细胞膜表面积存在一定的比例关 系，因此 ，可以用细胞膜 电容的变化过程反映细胞的分泌过程 I采用细胞膜电容的相对变化幅 度 C来表征细胞的分泌活性 ，即C=终结膜 电容量 ／初始膜电容量． 1．3 实验过程 温孵后的细胞移入放有细胞外液的培养皿中，室温 23～26℃ 下进行实验．当电极尖靖 (尖端直径约 1肿 ，电极电阻 2．5～4．5Mn)与细胞膜形成高阻(10～20Gn 以上)封接时． 对电极内施加负压 ，吸破电极尖端的膜片，形成标准全细胞记录模式．向细胞施加--