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RNA的提取及定量检测 RNA的提取及定量检测 RNA降解的主要因素及RNase的去除 DNA污染的解决方案 RNA的质量检测 RNA降解的主要因素 体内RNase的影响 样品取材要新鲜，并且在液氮或-70℃冰箱中冻存。 RNA提取试剂的选择，TRIzol Reagent 或试剂盒。 匀浆器或是研钵；破碎细胞要快速；尽量在低温下进行。 体外RNase的影响 空气中的RNase 试剂中带有的RNase 实验耗材 实验者本身 体外RNase的去除 玻璃仪器的处理 高温烘烤 塑料材料的处理 DEPC-H2O浸泡，氯仿擦 有机材料的处理 DEPC-H2O浸泡 电泳设备的处理方法 水→70％乙醇→ 1M NaOH → DEPC-H2O 实验者本身 手套、口罩 操作环境 操作台、周围环境 用TRIzol Reagent提取总RNA 1. 将处理好的叶片剪下，约100mg ，放入处理过的研钵中，加入1mL Trizol，研磨。 2. 抽吸上清液，转移到用DEPC-H2O处理过的灭菌的1.5 mL离心管中。 3. 加入100 μL氯仿剧烈震荡混匀30秒。 4. 用台式离心机，12,000 rpm，低温离心5分钟。 5. 重复步骤3一次。 6. 将上清（450 μL）小心转移到RNase-free 1.5 mL离心管中，加入900 μL异丙醇，混匀静置5分钟。 7. 12,000rpm室温离心10分钟。 8. 弃去上清，用70％乙醇清洗沉淀2次。 9. 弃去乙醇，在室温下干燥沉淀15分钟。 10. DEPC-H2O溶解沉淀，室温或55~80℃放置2分钟，促进溶解。离心管内的溶液为RNA样品，可立即使用或者-80℃保存。 上海生工 UNIQ-10柱式Trizol 总RNA抽提试剂盒提取RNA 1.将处理好的叶片剪下，约100mg ，放入处理过的匀浆器中，加入1mL Trizol，匀浆。 2.抽吸匀浆液，转移到用DEPC-H2O处理过的灭菌的1.5 mL离心管中。 3.加入100 μL氯仿剧烈震荡混匀30秒。 4.用台式离心机，12,000 rpm，室温离心5分钟。 5.将上清（450 μL）小心转移到RNase-free 1.5 mL离心管中，加入150 μL无水乙醇，混匀。 6.小心将步骤5中的溶液全部转移到套放于收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2分钟，8,000rpm室温离心1分钟。可适当降低离心转速。 7.小心取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，加入450 μL RPE Solution，10,000rpm室温离心30秒。 8.重复步骤7一次。 9.小心取出柱，弃去收集管中的废液，将柱放回收集管中，10,000rpm室温离心1分钟。 10.小心取出柱，放到无菌RNase-free 1.5 mL离心管里，在柱内膜的中央小心加入40 μL DEPC-H2O，室温或55~80℃放置2分钟。 11.10,000rpm，室温离心1分钟。离心管内的溶液为RNA样品，可立即使用或者—80℃保存。 DNA污染的解决方案 在微量Tube中配置下列反应液，总量50μL 总RNA 20～50μg 10 X DNaseⅠBuffer 5μL DNaseⅠ(RNase-free) 2μL RNase Inhibitor(40U/μL) 1μL DEPC 水 　 up to 50μL 37℃反应30～45分钟。 加入50μL的DEPC处理的水。 加入100μL（等量）的苯酚/氯仿（1:1），充分混匀。 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。 加入100μL（等量）的氯仿，充分混匀。 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。 加入10μL（1/10量）的3M NaAc(pH5.2)。 加入250μL（2.5倍量）的冰无水乙醇，-80℃放置过夜。 离心回收沉淀，用70％的冰乙醇清洗沉淀，真空干燥。 用适量的DEPC处理水溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA。 RNA的质量检测 紫外定量和检测 用紫外分光光度计检测RNA的产量，在260nm处的吸光度，1OD=40ug/ml。 根据在260nm和280nm处的吸光值，检测RNA的纯度,纯RNA的OD260/OD280比值应接近2.0(比值最好在1.9