细胞培养的基本方法.ppt

细胞培养的基本方法 细胞培养的基本概念 细胞培养的目的与用途 细胞培养主要的设施器材 细胞培养的条件 设施、器材、试剂实物图 培养细胞的分类 原代培养 原代消化培养法 原代组织块培养法 细胞的传代 细胞的传代 细胞的传代 细胞的换液 细胞的冻存 细胞的冻存 细胞冻存的注意事项： 细胞的复苏 细胞的复苏 细胞复苏的注意事项 细胞污染时的处理 其他注意事项 Thank You! * * * L/O/G/O 2 细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内 环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一 一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞， 也可以是细胞群。 2 一、基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 二、科学研究: (1) 新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等. (2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等. (3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4) 单克隆抗体制备 2 设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。???????????????????????????????????????????? 二、塑料器材 多孔培养板（6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头 （1）适宜的温度和PH 37℃，pH7.2~7.4。 （2）气体环境 95%空气+5% CO2; 适宜的湿度（无菌水不能干掉）。 （CO2：细胞生长所必需的成分, pH值维持，最低不能低于1%。） （3）营养物质 N 源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。 常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199 等。 （4）无菌条件 紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。 按照是否贴壁： 贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质 细胞等。 悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。 按照传代次数： 原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之 内的细胞统称为原代细胞。） 细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、 CHO细胞等。 原理： 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、 螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培 养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。 （1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 ? （2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。? （4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。 （5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。 （6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。 （1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，