Southern印迹技术应用和注意事项.ppt

Southern印迹 技术应用与注意事项 威斯腾生物技术中心 400-675-6758 具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。 一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段。 将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定。 再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。 三、操作步骤 技术简介 技术原理 操作步骤 注意事项 应用范围 案例分析 总结 （Edwin Mellor Southern UK） Southern印迹杂交（Southern blot）是1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 随后于1977年，Alwine等人应用类似方法用于检测经琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳中分离的特定RNA，此方法又称为Northern blot（Northern印迹）。 1979年Towbin等再将该方法扩展到特定的蛋白质检测或分析上，成为Western blot（Western 印迹） 一、技术简介 二、技术原理 文本 酶切 电泳 样本 准备 实验前 酶切位点、探针设计 转膜 固定 DNA提取及处理,探针标记 根据酶切位点进行样本的酶切，低压电泳分离DNA片段 处理电泳之后的凝胶，转膜，固定DNA 杂交 显色 杂交过夜，洗膜并显色 三、操作步骤-酶切位点，探针设计 酶切位点设计原则： 1.根据实验目的设计酶切位点； 2.选用酶切效率高的常用限制性内切酶； 3.选用1-2种内切酶。 探针设计： 1.设计引物，遵循引物设计原则。 2.片段长度根据酶切后片段大小决定，不宜过长，否则会影响杂交过程中与膜上样本的结合效率。 三、操作步骤-样本准备 DNA提取常用方法: 1.CTAB 法提取DNA 取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； 加入800 μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min； 小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min； 小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。 重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止； 取上清，-20℃沉淀过夜h，4℃，12000 r/min，离心10 min； 弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次； 室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。 2.Chelex-100树脂法 3.试剂盒抽提 4.磁珠提取法 三、操作步骤-探针标记 用引物TF和TR进行PCR扩增制备探针，胶回收产物，再用标志物进行标记。 常用标志物： 同位素——灵敏度高，效果好； 地高辛——安全性好； 将扩增得到的探针片段煮沸处理，冰浴5min，加入DIG，37℃孵育过夜。 T4多聚核苷酸激酶——人工合成的短寡核苷酸。 10×FD buffer 4.5 μL 酶1 2 μL 酶2 2 μL 基因组 6 μg ddH2O 水至45 μL 总体积 45 μL 三、操作步骤-酶切和电泳 酶切: 取样本，加入限制性内切酶，37℃酶切1h左右，待样本酶切到适宜程度，即可终止反应，用作后续试验。 电泳： 酶切1.5 h后，取2μL酶切DNA样品于1%的琼脂糖凝胶上进行检测，判断酶切程度。当酶切充分时，制备1%的琼脂糖电泳凝胶，样品中加入10×loading buffer，于30-40 V稳压电泳 4-5 h（包括DNA Marker和阳性对照质粒）。 电泳完成之后，切下样品及质粒部分的凝胶，剩余DNA Marker部分则单独浸泡在添加了10 μL 10 mg/ mL溴化乙锭（EB）的100 mL 1× TAE buffer中染色30 min。 三、操作步骤-转膜、固定 电泳凝胶预处理 1) 将凝胶浸于适量变性液中（浸没凝胶），室温，于水平摇床上低速晃动15 min，并重复一次