质粒小提提仿单.doc

质粒小提实验步骤 这个操作方案可以从过夜培养的1.0-5.0 ml 培养物能得到5-30 μg 的高拷贝数的质粒或1-10 ug 低拷贝数的质粒DNA。如果需要提高低拷贝数质粒的产量，按下面的低拷贝数的方案。 1. 将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有5 ml LB/氨苄青霉素的10-20ml 的培养管，37℃搖床培养12~16 h，以扩增质粒。用一个10-20ml 培养管或培养瓶，其体积至少有培养基的4 倍。建议使用endA 敏感型的E. coli 菌株来作常规质粒的分离，例如DH5α?和JM109?等菌株。 2. 取1.5~5.0 ml 的菌液，于室温下10,000 x g 离心1min 以沉淀菌种。 3. 倒出或吸出培养基，弃去。往沉淀中加入250 μlSolutionⅠ/RNaseA 混和液，漩涡振荡使细胞完全重新悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高的产量是十分重要的。 4. 往重悬混和液中加入250 μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10 次。如有必要，可把裂解液置于室温静置2min，避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体DNA 断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过5min。（当使用完SolutionⅡ以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的CO2 反应。） 5. 往上述混和液中加入125 ul 冰浴Buffer N3，并温和地上下颠倒离心管数次混匀，直至形成白色絮狀沉淀。 6. 室温下，≥12000 x g 离心10min。 7. 小心将上清倒入干净的1.5ml 离心管中，加入0.1 倍体积的ETR 溶液（蓝色）至上清液中，颠倒试管7-10 次，然后于冰浴中静置10 min。 注意：在加入ETR 溶液后，裂解液可能出现浑浊，但冰浴后将逐渐转为澄清。 8. 将上述裂解液于42℃下静置5 min。裂解液又将再次出现浑浊。此时，立即于25℃ 12，000 x g 离心3min， ETR 9. 将上清液移至另一新的1.5 ml 离心管中，加入1/2 倍体积室温的无水乙醇，轻轻颠倒试管6-7 次，室温放置1-2 min。 10. 取一干净的HiBind Mini Columns(I)裝在一个2 ml 收集试管上(已备)。小心吸出上清，取700 ul 样品溶液将其转至于柱子內，于室温下10,000 x g 离心1min，使裂解液完全流过柱子。( HiBind DNA 柱子一次最多能装700ul 溶液) 11. 弃去收集管种的滤液，将剩余的样品溶液转移至柱子中，于室温下10,000xg 离心1min，使裂解液完全流过柱子，弃滤液。 12. 把柱子重新装在收集管中，加入500μlHBBuffer 柱子上，室温下10,000xg 离心1min洗涤柱子，确保除去残余的蛋白质以得到后面操作所需的高质量DNA。 13. 弃去收集液，加入700μl DNA Wash Buffer (用无水乙醇稀释的)洗涤柱子，室温10,000xg离心1min，弃去洗涤液。 注意：浓缩的DNA 洗涤缓冲液在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。 14. 重复步骤13，再用700μl 的 DNA 洗涤缓冲液洗涤柱子一次。 15. 室温下最高速（≥13,000xg）离心空柱2min 以甩干柱子基质。 注意：不要忽略此步――这对从柱子上除去乙醇至关重要。 16. 把柱子置于一干净的1.5ml 小离心管上，直接加入30~50μl Elution Buffer（或无菌去离子水，或10mM Tris-HCl，pH8.5）到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min。≥13,000xg 离心1min 以洗脱出DNA。 这步可以洗脱70-85%的DNA，若进行第二次洗脱则可得到大部分残余的DNA，只是浓度较低。 低拷贝数质粒方案: 低拷贝数的质粒通常情况下从每毫升过夜培养的菌液中可得到0.1-1ug DNA。对于从低拷贝数质粒（0.1-1ug/ml 培养基）或低-中量拷贝数质粒（1-2ug/ml）细菌中分离质粒，如有需要，可以通过改良这方法来提高产量。 开始用10-15ml 菌液，15ml 离心管5000xg 离心10min。进行方案1 的第3 步，加入两倍体积的溶液Ⅰ、Ⅱ、N3、ETR Solution。用一个微量结合柱继续按照前面的操作进行，。不须要加大HB 和Wash Buffer 的用量。溶液Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ可以单独购买。 注意：这方法不适用于高拷贝数质粒，因为超过15ml 培养基，大量结合柱很快就会饱和。这种情况下，我们推荐把同一培养基里的样品分成多个样品处理。