实验七利用RT-PCR分析基因表达.pptVIP

实验七 利用RT-PCR技术分析基因表达 一、实验目的 掌握RT-PCR反应的基本原理；学习利用RT-PCR进行基因表达分析的基本技术。 二、实验原理 反转录多聚酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)是对特定的RNA分子进行扩增的技术，可分成两个部分：（1）将目的RNA反转录( RT）为complementary DNA（cDNA）;（2）以此cDNA为模板进行聚合酶链式扩增（PCR）。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，如检测细胞中特异基因在mRNA水平的表达情况；检测细胞中RNA病毒的含量；从mRNA直接克隆特定基因而不必构建cDNA文库等。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法中，cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出部分反应产物在另一缓冲系统进行PCR；在一步法中，逆转录和PCR在同一缓冲体系中顺次进行。本实验将利用一步法对从拟南芥叶片中CaM5基因在mRNA上的表达水平进行分析。 三、实验材料 实验五的拟南芥叶片总RNA 四、实验试剂 1. primeScript 1 step Enzyme mix Primescript RTase EX Taq HS RNase inhibitor 2. 2×1 step buffer 10× one step RT-PCR buffer One step enhancer solution dNTP mixture 3. 前向引物(10uM)：5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATCA -3’ 反向引物(10uM)：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA -3’ 4. 1.0% 琼脂糖凝胶 五、实验步骤 1. RT-PCR反应混合液的配制 (25μl) 2×1 step buffer 12.5μl primeScript 1 step Enzyme mix 1μl 前向引物 (P1) 1μl 反向引物 (P2) 1μl 总RNA 模板 1μl RNase Free dH2O 8.5μl 所有试剂按量仔细添加后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，最后添加15μl矿物油。 2、PCR仪的参数设置 50 ℃ 30 min 94℃ 2 min 94 ℃ 30 sec 35 cycles 62 ℃ 30 sec 72 ℃ 30 sec 72 ℃ 5 min 3、琼脂糖凝胶电泳检测 反应结束后，取5μl RT-PCR产品，加入1μl 6 x loading buffer，混匀后点样，电泳15min。 六、实验结果与分析 * * 基因组DNA水平上扩增的条带大小为992bp,其中外显子为450bp, 内含子为542bp. (2) mRNA水平上扩增的条带大小为450bp.