血清中miRNA抽提和实验设计经验谈.pdfVIP

血清中 m i R N A 抽提和实验设计经验谈 人体内的血液循环系统犹如印度的圣河 – 恒河，河水中携带的养分滋养着古老的大 地；洗涤带走地上的 ㄧ切污秽，人们的一生都在河水中完成。如此的恒河可以想象，河水中 充斥着各种物质，有废物有养分，只要你想都可以从河水中捞取。同样的我们的循环系统如 同恒河；流动的血液如同恒河水，身体所需的 ㄧ切由血液运送，身体产生的废物也由血液清 运，同样可以想象血中的成份也是包罗万象。如果我们想知道大地有多纯净或污染有多严重， 只要取一瓢水加以检视就可以知道答案；而相同的想了解人的生理状况，取一滴血加以检验 也可以知道端倪，但是做这些检测并非漫无目标的，必须要知道哪 ㄧ些物质是所谓的指针， 在生物体内的这些指针就是我们熟知的生物标记 (biomarker)。生物标记的研究和应用已有 ㄧ段光景，各项代谢疾病的筛检广泛的被使用，而在癌症的筛检也已经有 ㄧ些不错的生物标 记，例如 AFP (Alpha-fetoprotein)。顺着microRNA (miRNA) 的发现和研究热潮，已经约 有 1000 个 miRNA 被发掘表现于人体中，miRNA调控人体内基因表现的生理功能也为人们所 熟知，加上 miRNA 相对于蛋白质标志的高稳定性，伴随着检测技术的一日千里，让血液中 的 miRNA 表现成为新一代寻找生物标记的标的。本文内容介绍主要是以实验室在操作血清 miRNA 的萃取和芯片实验所累积的经验，和读者分享实验上遇到的一些难题和解决的方法。 血液中 miRNA 的组成 血液中的 miRNA 到底是从何而来? 要往哪里去? 这些 miRNA 的生理功能是什么?以上这三 个问题是很多研究人员关心的问题，事实上这些问题目前并没有很明确的答案，我们知道 miRNA 是内生性的短片段 RNA，长度约 17 到 23 核苷酸，miRNA 可以藉由和信息 RNA (mRNA) 结合诱导信息 RNA 的降解，进而调控信息 RNA 和相对蛋白的表现。根据一些论文 的揭示1和实验室实际的操作经验显示，正常人的血液中 miRNA 的含量是极微量的，但是在 病人和检体制备不佳的血液样本中却可抽取到较大量的 miRNA，根据这些观察现象的合理臆 测，病人血清中 miRNA 的来源，很有可能是因疾病造成的组织坏死或细胞凋亡破裂而流泄 出来的胞内 miRNA，经由病人和正常人的基因表现的芯片图谱比较，结果也倾向有或无表现 的差异，而非特定 miRNA 表现量上升；换言之，我们观察到相关的研究中，病人的 miRNA 的表现数目增加了，而分析 ㄧ些在正常人和病人中都有表现的 miRNA，表现量的高、低反而 是其次的表征。因此数据分析的逻辑和方法也必须根据之而调整， 但这些呈现异位性表现 (ectopic expression)的 miRNA 并不影响其成为诊断疾病和预后评估的标志的可能性。已 全国统一服务热线：400-6506-908 官方网站： 地址：北京市西城区车公庄大街甲 4 号物华大厦 A 2201 邮箱：marketing@ 经有一些研究指出，这些不经常表现在循环系统的 miRNA 可以成为良好的疾病诊断标志， 如 miR-141 可以作为前列腺癌的指标，miR-499 及 miR-208 和心肌梗塞(myocardial infraction)相关，miR-122 和药物造成的肝脏损伤有关。 血清中 miRNA 抽提的挑战 1 、检体的备制： 血清 (serum) 好还是血浆 (plasma)好? 临床上会根据检验的标的来选择血液检体的保存及制备方式，血清和血浆都是来自血液 检体的成分，但是根据制备的方式导致本质上含有成分有所不同。基于制备的方法可知，血 清是血液经由凝血反应后，再经由离心沈淀所得到的上清液。而血浆则是血液在不凝血的状 况下，经由离心去除血球后的液体。然而有文献指出，针对同一个人的血清和血浆样本抽提 出来的 miRNA 的总量作比较，很明显的血清抽提的总量明显比血浆抽提的来得高， 这意谓 着制备的方法也会影响miRNA 的抽提，据推测这些 miRNA 可能是因为凝血反应，血小板或 红血球破裂后释出的物质，其中包含 miRNA，虽然大部分的实时定量聚合链反应 (q-PCR)验 证结果显示， 血浆和血液的miRNA 的表现图谱并无显著差异，然而这个已经存在的风险， 可能在研究设计也是需要被考虑，因此就理论上来说，是以血浆的检体较适合作为生物标记 的找寻1。 2、检体