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放线菌杂交育种 第二组 放线菌的简介 放线菌形态结构 放线菌的繁殖 放线菌杂交概况和原理 放线菌的杂交技术 放线菌简介 细菌的一个大类群，为革兰氏阳性。 多为腐生，少数为寄生。寄生型放线菌会引起放线菌病和诺卡氏病。 是工业发酵产品的主要生产菌种来源，尤其是抗生素、四环素、土霉素、卡那霉素等都由放线菌产生 放线菌的形态结构 放线菌菌体为单细胞，大多数由分枝发达的菌丝组成。根据放线菌菌丝的形态和功能分为营养菌丝、气生菌丝和孢子丝三种. 营养菌丝 又称为初级菌丝体、一级菌丝体或基内菌丝，匍匐生长于培养基内，主要生理功能是吸收营养物。 营养菌丝一般无隔膜；直径0.2~0.8?m；长度差别很大；短的小于100 ?m，长的可达600 ?m. 有的产生色素：黄、橙、红、紫、蓝、绿、灰、褐、黑等，包括脂溶性和水溶性，脂溶性色素局限于菌丝，水溶性色素可在培养基中扩散。 放线菌杂交原理 放线菌只有一条环状染色体，基因重组过程类似于大肠杆菌，大体上有以下四种遗传体系。 放线菌的杂交过程 （1）接合 两个不同基因型的菌株通过接合，供体菌株的部分染色体转移到受体细胞中，形成局部结合子 （2）杂合系和重组体杂合系 局部结合子形成后，在繁殖复制过程中，两个不同基因型染色体进行一次交换，产生杂合系，使交换后的染色体不是环状结构而是线状的，并且在染色体的末端具有串联的重复体。在复制过程中，开口的环状染色体上基因再一次交换，产生不同基因型的重组杂合系。 （3）重组体 杂合系或重组杂合系在以后的进一步繁殖复制过程中，杂合状态染色体的不同区段还要进行几次交换，才能形成不同类型的重组体。杂合系是形成重组体所必需的阶段。 放线菌杂交技术 常用放线菌杂交方法： 混合培养法 玻璃纸转移法 平板杂交法 混合培养法 两亲株是互补营养缺陷型，两亲株混合，接种到CM斜面上(其中一株产生孢慢时可多接一些)，孢子形成后制成单孢子悬浮液，然后在SM平板上分离，长出菌落即为重组体。 玻璃纸杂交法 原理：异核体带有链霉素敏感的等位基因，在含链霉素的SM上不生长。敏感性亲本和抗药性亲本因营养要求得不到满足也不能在该SM上生长。而不带链霉素敏感等位基因的两直接亲本的局部结合子则能在该SM上生长。 使用本法必须具备两个条件： 第一，直接亲本必须带有两个遗传标记，即一个直接亲本带有一种营养要求和抗药性（如抗链霉素）；而另一个直接亲本则为对该药物敏感（如对链霉素敏感）和带有另一种营养缺陷型。 玻璃纸法平板杂交的具体方法 （1）在两个直接亲本的新鲜、成熟孢子斜面中加入无菌水，轻轻刮下孢子，制成孢子悬液。 （2）混合液接种到覆盖在完全培养基平板上半透型的玻璃纸表面，置于适当温度培养24h。待玻璃纸表面布满一层基质菌丝而未长出气生菌丝，这时可终止培养。 （3）用无菌镊子将玻璃纸以无菌操作转移到CM+链霉素琼脂平板上，室温下继续培养。 （4）当基质菌丝停止生长，杂合系的气生菌丝在玻璃纸表面开始生长，可用微针挑取杂合系的菌丝丛，进一步分析，检出分离子。 分离子的检出与鉴别 方法一：事先准备好MM平板，在其上滴一点含有0.01%月桂酸钠的无菌水，挑取杂合系菌丝丛于水滴中涂抹均匀，适温培养即可长出各种分离子。 方法二:挑取杂合系菌丝丛，加入到盛有一定量无菌水的试管内，制备单孢子菌悬液，分离于完全培养基平板上，菌落形成后，用影印法复印到各种选择性培养平板上，可以鉴别出不同类型的重组分离子。 玻璃纸杂交法法优点 玻璃纸杂交法不仅可以分离杂合系，而且可以分析杂合系。与混合培养法中的杂合系分析相比，玻璃纸杂交法较为简单，时程也短。玻璃纸杂交法可以在一定时间间隔中断杂交，可对杂交过程或染色体转移在时间上进行控制，以利于研究杂交过程。 平板杂交法 将菌落培养在非选择性培养基上，形成孢子后，用影印培养法将菌落印至铺有试验菌孢子(107～109个/mL)的CM平板上培养至孢子形成。把形成的孢子影印到一系列SM上—筛选各种重组体子代。 平板杂交法具体方法 （1）将亲本菌株A的菌落以点种法分别接种到MM上，培养后形成大量孢子，备用 （2）将B亲本的孢子悬液加到LM上，涂布培养，备用 （3）将点种长好孢子的A采用影印法复印到长满B孢子的培养平板上，继续培养，A、B亲本的孢子萌发，长成菌丝，相互接触形成局部结合子，形成杂合系。进一步培养，繁殖复制，杂合系形成孢子，采用影印法将杂合系孢子复印到各种选择性培养基平板上，从中检出重组体分离子。 平板杂交法的优点 能迅速地大量杂交，尤其是确定大量菌落与一个共同试验菌配对时的致育力更为方便。一个培养皿可排列20个菌株与一株配对菌株杂交。 气生菌丝 又称为二级菌丝体。营