核酸的体外扩增(PCR).pptVIP

医学分子生物学 第十一章 核酸的体外扩增 第一节 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction PCR 一、PCR的基本原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR三步曲 变性 90～97℃ 退火 45～55℃ 延伸 72℃左右 二、PCR引物设计 一对引物，与3′端互补 长度：15～30个核苷酸 碱基分布随机 引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性 3′端必须互补 5′端可游离 三、模板的制备 DNA 从细胞中提取DNA：血细胞、绒毛、尿样、毛发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化 RNA 新鲜组织或细胞 所用器皿和试剂必需经高温灭菌或DEPC处理 四、PCR的基本反应 （一）、以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 　 10 ?l 4种dNTP混合物 　 各200 ?mol/L引物 　　　　 　 各10～100 pmol　模板DNA 　　　 　0.1～2 ?g　Taq DNA聚合酶 　 2.5 u　Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 　 100 ?l  PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermusaquaticus