第七节仪器分析-2.ppt

第二节 免疫分析方法及其应用 一 放射免疫分析法 利用放射性核素可探测的灵敏性，精确性与抗原抗体反应的特异性相结合而创建的一类免疫测定技术。 基本类型和原理 竞争性结合反应：放射免疫分析(RIA）--以放射核素标记抗原与反应系统中未标记的抗原竞争特异性抗体的基本原理来测定待检样品中抗原量的分析方法。 非竞争性结合反应：免疫放射分析(IRMA)—用放射性核素标记的过量抗体非竞争结合抗原，经固相分离，测定待测样品中抗原量的分析方法。 2.常用的放射性核素 125I、131I、3H、14C。 3. 标记物的制备及鉴定 标记物：是指通过直接或间接的化学反应将放射性核素连接到被标记分子上锁形成的化合物。 要求：高比度、高纯度、完整的免疫活性、不能破坏抗原决定簇。 直接标记法（铬氨酸残基和组氨残基） 间接标记法（联接标记，引入添加基团） 标记物的纯化：采用分离的方法—离子交换层析法。 标记物的鉴定：放射化学纯度、免疫活性、比放射性（计算法和自身置换法）。 4. 放射免疫分析一、原理： Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag * Ag和 Ab量恒定， Ag的量为一个系列浓度。 抗原抗体复合物与标准抗原的关系 * AgAb复合物的量取决于Ag的量 Ag量越大， * AgAb量越少 Ag量越小， * AgAb量越大 测量* AgAb量或测量多余* Ag量可推算出Ag量 二. 标准曲线的建立 以* AgAb的放射性强度与* Ag的放射性强度的比值或以* AgAb的放射性强度与总放射性强度的比值作纵坐标，标准抗原浓度为横坐标做曲线，得到一条标准曲线。 在同样条件下测定样品，计算出抗原抗体复合物的放射性强度与总放射性强度的比值，在标准曲线上找出待测抗原的量。 二、测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37℃或4 ℃温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度 二. 免疫放射分析方法 单位点IRMA：先将过量的标记抗体与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物，反应平衡后，用固相抗原结合反应液中剩余的游离标记抗体，然后进行分离，测定抗原抗体复合物的放射量。 双位点IRMA：先用固相抗体与抗原反应，然后再用过量的标记抗体与已结合于固相抗原的另外一个抗原决定簇结合，形成抗体-抗原-标记抗体复合物，分离出剩余的标记抗体，测定固相上的放射性。 IRMA与RIA的比较 二. 荧光免疫分析方法 荧光免疫技术是以荧光素标记的特异性抗体或抗原作为试剂，用于相应抗体或抗原的分析鉴定和定量测定，主要有荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两种类型。 非均相荧光免疫测定法：需要分离抗原抗体复合物和剩余的标记物，然后测定复合物或剩余标记物的量，从而计算出标本中的抗原量。 均相荧光免疫测定法：不需要分离复合物与剩余标记物，直接测定剩余的标记物的量，计算出标本中的抗原量。 一、分子发光分析法及其分类 某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法 根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光 电致发光：以电能来激发而发光—原子发射光谱法 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法 荧光效率：发射荧光的光量子数与吸收光的光量子数的比值 荧光淬灭：处于激发态的电子不能回复到基态，所吸收的能量不能以荧光的形式发射。 荧光素：具有光致荧光特性的染料。 时间分辨荧光免疫测定法 以镧系元素螯合物标记抗体或抗原，利用荧光发射体荧光寿命差别而将波长相同的荧光分开的技术。 原理：镧系元素与螯合物络合，再与抗原或抗体结合，加入荧光增强剂，紫外光照射激发出荧光，进而测定。 主要类型； 固相双位点夹心法：待测物与固相抗体反应后，再加入Eu3+标记抗体反应，生成Eu3+标记抗体-抗原-固相抗体复合物，所测荧光强度与待测物浓度呈正比。 固相抗原竞争法:将大分子抗原包被在固相上成为固相抗原，固相抗原与待测抗原共同竞争限量的Eu3+标记抗体，待测抗原浓度越高，固相抗原结合的标记抗体就越小，所测荧光强度与待测物浓度呈反比。 固相抗体竞争法 待测抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体发生竞争性结合，分离剩余的Eu3+标记抗原与Eu3+标记抗原抗体复合物，在固相中加入增强剂，