实验四十四DNA 的萃取一、 目的不同的细菌所表现出的特性.pdfVIP

微生物學實驗 實驗四十四 DNA 的萃取 一、 目的 不同的細菌所表現出的特性會有所不同，例如其構造 、形狀、生長、代謝及 致病性的各種差異，這些特性都是藉由細菌的 DNA 所控制。本實驗將介紹如何從 細菌內萃取出 DNA 以及分析 DNA 的方法。 二、原理 將細菌溶液加入有機溶劑，除去蛋白質及其他成分，藉以純化 DNA 。一般常 利用酚及氯仿混合液 (phenol/chloroform) 使蛋白質變性 (denaturaion) 來進行萃 取的步驟。DNA 的分析是藉由螢光染劑 ethidium bromide (EtBr)嵌入雙股核 酸氫 鍵之間，再用洋菜膠 (agarose) 來分離不同大小的 DNA 片段，在紫外光下顯現螢 光橘色的片段。 三、 材料與設備 (一) 材料 1. 細菌(E. coli.) 2. LB 液體培養基 3. STE buffer (Sodium Chloride Tris EDTA) ：Sodium Chloride 0.1 M ，Tris (pH 8.0) 10 mM ，EDTA (pH 8.0) 1 mM 4. 20% SDS 溶液 (Sodium Dodecyl Sulfate) 8-1 第八章 微生物的遺傳特性 5. Proteinase K (4 mg/ml) 6. RNase A (4 mg/ml) 7. Phenol/Chloroform (1 ：1) 8. 3 M NaOAc 溶液 (sodium acetate) 9. 70%及 95%酒精 10. Agarose 11. 5X TBE buffer （Tris Boric acid EDTA ） 12. EtBr 溴化乙啶染劑 13. 6X loading dye 14. 1 kb DNA marker 15. 1.5 ml 微量離心管 16. 15 ml 離心管 17. 離心管架 18. 2 µl 、20 µl 、200 µl 及 1 ml 無菌微量吸管 19. 滅菌水 20. parafilm (二) 設備 1. 恆溫培養箱 2. 低溫離心機 3. 桌上型離心機 4. 乾浴器 5. 鑄膠盒 6. 電泳槽 8-2 微生物學實驗 7. UV 照射板 8. 照相設備 9. 抽氣櫃 10. 無菌操作台 四、 方法與步驟 利用 LB 液體培養基在 37 ℃下孵育 E. coli 到隔夜。 (一) 染色體 DNA 的萃取 1. 取 1.5 ml 隔夜培養的大腸桿菌液，放入微量離心管中。 2. 離心，10000 rpm ，5 分鐘，使菌體沉下。 3. 倒掉上層液，加入 1 ml STE buffer ，輕輕混合均勻，置冰上3 分鐘。 4. 使用低溫離心機進行 4℃離心，10000 rpm ，5 分鐘。 5. 倒掉上層液，加入 0.4 ml STE buffer ，使菌體分散成懸浮液。 6. 加入 12.5 µl 的 20 % SDS 溶液，充分混合。 7. 加入 12.5 µl 之 proteinase K ，完全混合，置於乾浴器上55℃作用 1 小時。 8. 加入 RNase A 1.5 µl ，37℃作用 1 小時。 9. 加入與菌液等量的 phenol/chloroform (1 ：1) ，充分混合。 10. 於低溫離心機進行 4℃離心，13000 rpm ，10 分鐘。 11. 取出上層液，移至新的微量離心管中