第五节+凝胶过滤.pptVIP

第五章 凝胶过滤 ;是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。 又叫分子筛层析—凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。;不同类型凝胶的筛孔的大小不同;凝胶过滤基本原理;中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 ;带网孔的葡聚糖珠;凝胶过滤层析过程示意图;凝胶过滤的优点：;适用：;第一节 凝胶的分类及性质;分类;;;一、 葡聚糖凝胶;;1．理化性质 ;1）以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。 2）以LH型葡聚糖凝胶作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。;2．稳定性;当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否则，微生物将生长。;3．吸附性;二、琼脂糖凝胶; 琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称 Sepharose美国称 Bio-gel A英国称 Segavac丹麦称 Gelarose我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。;琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B（2％浓度）、4B（4％）和6B（6％）。Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。 琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。;CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇（1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。 ;琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。;三、聚丙烯酰胺凝胶;一般聚丙烯酰胺凝胶均制成珠状颗粒，以干凝胶形式出售，使用前必须溶胀。 特点： 不溶于水和普通有机溶剂； 能在浓盐、尿素和胍盐等溶液中浸泡； 在pH l-10或短时间超过此pH值的溶液中较稳定； 要避免长期与强酸和强碱接触，否则，酰胺基将迅速发生分解（高温条件）。;缺点： 对芳香族的、酸性和碱性的化合物稍有吸附现象，使用离子强度略高的洗脱液操作可以克服。 ;四、 Sephacryl;;特点：;Sephacryl 能用于分离蛋白质、核酸、多糖和蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的病毒颗粒（直径 300-400 nm）的分离。层析时，用细颗粒凝胶分辨率高。 ;第二节 基本原理; 洗脱体积（Ve）包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。?Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。 对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积 Ve ＝ Vo 对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积 Ve ＝ Vt 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。;;;对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0 对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1 Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系： Kav ＝ －b lgMr+c 由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b lgMr+c ;通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过标准曲线即可求出其分子质量。 ; 蛋白质通过凝胶柱的速度即洗脱体积与其分子量有关， ;影响筛分效果的因素：;第三节 操 作;在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25。当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类扩散到凝胶网孔里后流出来。这样蛋白质就得到纯化。 一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分