3.三基因工程载体.pptVIP

表达形式 单一型表达：单一基因的编码区，表达完整单一蛋白。 融合型表达：多个基因的编码区的串联体，表达出融合蛋白(fusion protein)。 融合标签蛋白：有利于蛋白纯化和检测； 融合多个目标蛋白：则类似于直接表达了一个多酶复合体一样，可减少载体构建难度，而且可以偶连两个或多个相关基因的表达。 一、质粒表达载体 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 表达形式 组成型表达：在组成型启动子（如：T7噬菌体启动子）的驱动下即可源源不断的表达外源基因。 适合对宿主细胞无毒的蛋白表达。 诱导型表达：在诱导型启动子和特定环境信号刺激下，外源基因的表达开放或增强。 适合有毒蛋白表达，无毒蛋白表达也可。 一、质粒表达载体 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 表达融合蛋白的表达载体 6 ×His（组氨酸）标签表达载体：pET系列，可在目标蛋白的N-端或C-端加上6个组氨酸的标签，能与镍等二价金属离子结合，纯化目的蛋白。 GST (glutahione S-transferase, 谷胱苷肽S-转移酶)表达载体：pGEX系列，融合蛋白纯化出来后用凝血蛋白酶切割可得到纯的目的蛋白。 一、质粒表达载体 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 一、质粒表达载体 (二)酵母表达载体——真核表达的首选系统 原核生物和真核生物存在翻译后修饰反应机制的差异， 真核基因在原核表达系统中难以获得有活性的蛋白。 酵母表达载体是一种穿梭表达载体：既能在大肠杆菌中繁殖，又能在酵母中复制、表达。 Yeast复制起点 E.coli复制起点 E.coli选择标记 Yeast选择标记 MCS Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. A、删除不必要的DNA区域: 尽量缩小质粒的分子量，以提高外源DNA片段的装载量。 B、减少限制性酶切点: 缺失突变，限制性酶、核酸外切酶和连接酶的共同作用，机械破碎和质粒之间的重组等方法。 C、加入易于识别的选择标记：通过质粒之间的重组，可以使质粒带有合适的选择性标记。 D、安全性能改造：质粒载体不能在细菌之间随便转移。 E、改造或加入基因表达的调控序列：启动子。 质粒的改造 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 一、 质粒载体 6.常用质粒载体 复制起点? 遗传标记基因 克隆位点 克隆位点 在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。 TC r （1） pBR322 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 一、 质粒载体 含有pBR322完整的Ampr基因和复制起始点。 含有大肠杆菌? -半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码? -肽链的DNA序列，即lacZ’基因。 在lacZ’基因中靠近5’端的一段有MCS区段，但并不破坏该基因的功能。 　 （2） pUC系列质粒载体 　在pBR322的基础上改造而成。属正选择载体(转化载体后，阳性克隆在有选择压力的培养基上能正常生长)，其组成如下： Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 无质粒的 受体菌 ?-半乳糖苷酶部分缺