三 昆虫基础知.ppt

第三章 基因工程载体;在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。; （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。; 基因工程中常用的载体有5类： ;第一节 质粒载体 ;大肠杆菌的质粒;（1）分子小： ;（4）质粒的空间构型：;③ 线形DNA （ linear ，lDNA）;（5）质粒空间构型与电泳速率;二、质粒的类型;除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。;大肠杆菌接合（conjunction）;2. 非接合型质粒：;;带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。;三、质粒的复制类型;（1）分子量大，拷贝数低;;ColE1质粒的筛选标志是大肠杆菌素E1（colicin E1）。;ColE1;（1） 具有复制起点（ORI）;;氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）; 常用抗菌素的抗性工作原理;ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）;a）杀菌原理;iv）链霉素（Streptomycin，Str）;v）四环素（Tetracycline，Tet）;;;② 遗传标记;;当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;4. 人工构建的质粒载体的类型;（2）低拷贝数的质粒载体;（3）失控的质粒载体;（4） 插入失活型质粒载体;（5）正选择的质粒载体;（6） 表达型质粒载体;复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS;;五、经典的大肠杆菌质粒载体;6个克隆位点： EcoR I、Xho I、Pvu I、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。;;2. ColE1;;EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1（ColE1-），但仍然表现出对E1免疫型（ImmE1+）。;用对外源colicin E1的免疫性和自身不能合成colicin E1作选择，操作非常繁杂。 对colicin E1敏感的细菌群体中自发突变产生抗colicin E1的频率很高！;;pSP2124质粒的Ampr基因;;;（5）pBR322的优点;外源基因?BamH I;氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy;保留了转移蛋白（mob）的作用位点。;① 删除mob识别位点;pBR325：;4. pUC系列;① 复制起点;;pUC18/19;;Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。;?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。;③ lacZ的?肽互补;2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15）;pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。;4）?互补的插入失活;④ IPTG的诱导作用;通过看培养皿上的菌斑的颜色就能直接知道是否有DNA插入。;无质粒的 受体菌;;（5）pUC系列载体的优点;;六、其它质粒载体;① 如果加入纯化的T7或SP6 RNA聚合酶，在试管里就可以转录mRNA;3. 穿梭质粒载体;Yeast复制起点;（3）穿梭载体的优点;七、质粒载体的不稳定性;有主动分配和随机分配两种假说。;人工构建的质粒载体缺失了par区，只能以随机分配方式分到子细胞中。;在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。;4. 结构的不稳定性;（1）新陈代谢负荷：;每个菌体中所拥有的质粒拷贝数不完全相同，称差度。;野生型E.coli中，质粒在寄主的重组酶作用下会发生重组形成二聚体质粒。;第二节 噬菌体载体 ;single linear DNA (about 182,000 bp);T4 Bacteriophage;分为两种：;;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;2. 溶原周期：;;三、单链噬菌体载体;（2）复制型（RF）是双链环状DNA。;2. M13 噬菌体;M13序列;（4）M13的生活周期;;M13的包装过程：;3. M13载体的构建：;;在IG区内插入一个大肠杆菌的LacZ’（?-肽序列)。 利用?-肽序列中的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II 和 Pvu I）。;;（3）M13载体系列;;③ 对M13mp2的进一