分子生物学实验方法-1分子生物学.pptVIP

（Taq酶5′→3′外切酶活性在60℃最高也可通过温度梯度优化退火温度） 用λ噬菌体建立DNA文库示意图 其他载体： bacterial artificial chromosome (BAC) p1 artificial chromosome (PAC) yeast artificial chromosome (PAC) 5.3 RNA基本操作技术 总RNA的提取 mRNA的纯化 cDNA的合成 cDNA文库的构建 基因文库的筛选 5.3.1 总RNA的提取 RNA易遭降解，实验要求较严格。总RNA提取的方法有多种，主要有LiCl法、CTAB法、异硫氰酸胍法（TriZol）。 异硫氰酸胍法（TriZol）原理： TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。 5.3.2 mRNA的纯化 5.3.3 cDNA的合成 5.3.4 cDNA文库的构建 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA