禽大肠杆菌血清型李赫主要.pptVIP

禽大肠杆菌的分离培养和血清型鉴定 姓 名：李 赫 专 业：动物医学 导 师：胡桂学 教授 内容提要 前言 技术路线 实验结果 讨论 结论 前言(替换） 近年来，大肠杆菌的发病率越来越高，已超过新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等烈性传染病。大肠杆菌的血清型众多,从而给防治工作和养殖业带来了极大困难。 大肠杆菌抗原主要有O、K、H 3种，均为菌体表面抗原，是本菌血清型鉴定的物质基础。已确定的大肠杆菌O抗原有173种，K抗原有80多种，H抗原有56种。由于不同血清型大肠杆菌缺乏交叉免疫，给该 病预防带来困难。 本实验是从榆树某鸡场的成鸡和仔鸡的卵黄中，各分离到一株细菌，经生化鉴定后均为大肠杆菌，继而对分离到的大肠杆菌进行血清型鉴定。实验结果显示，从成鸡和仔鸡卵黄中的大肠杆菌的血清型均为O24。 实验路线 血清型鉴定 细菌计数 扩菌 O抗原的制备 细菌分离鉴定 实验路线 细菌分离鉴定（微改动） 1、细菌分离培养 以无菌操作的方法,取病料分别接种于肉汤、琼脂、伊红美蓝琼脂培养基上, 37℃培养24 h,挑选麦康凯琼脂平板上砖红色菌落接种普通琼脂斜面进行纯培养,培养后胶塞密封,置4℃冰箱保存备用。 2、细菌革兰氏染色 挑选单个菌落涂片革兰氏染色,进行菌体形态和染色特征的观察。以下为镜鉴结果图像。 实验路线 扩菌（改动） 细菌增殖 取大肠杆菌菌种，接种于麦康凯平板培养基上，挑取典型菌落接种于营养肉汤培养基中，于震荡培养箱中180rpm过夜，当培养基的OD值达到0.5时保存菌种 。 以下为大肠杆菌增值结果。 实验路线 细菌计数 1、倍比稀释与涂板 倍比稀释与图板的目的为确定菌液中菌数量，以为玻板凝集和试管凝集做准备。因实验各血清型菌种的实验途径一致，所以只用一种血清型为标准推算菌液浓度即可。实验时应注意实验设计，尽量在不影响观察结果的前提下节约实验耗材。 2、细菌计数 取出平板，用记号笔标记，查出平板上的细菌数量，观察相邻平板是否符合倍数稀释，然后根据倍比稀释公式计算原来菌液中细菌浓度，该公式为X＝u×10÷10（-n） O抗原的制备 将保存好的菌种接种于SS琼脂培养基上，均匀涂布，37℃温箱培养24小时后取出。用适量生理盐水洗下菌苔，移入含无菌玻璃珠的三角烧瓶中，充分振摇使菌体均匀分布，置100℃水浴2-2.5h，把菌悬液移入离心管，以离心，弃去上清液。将制得的菌体再用无菌生理盐水洗涤，以4000rpm离心10分钟，弃去上清液。取获得的一定量的菌体经无活菌检测合格后用生理盐水稀释成含细菌10亿个/ml的菌悬液，加0.5%石炭酸，置4℃的冰箱中保存备用 。 实验路线（替换） 血清型鉴定 1、试管凝集鉴定前验证试验 取7支凝集用试管分别按1:2、1:4、1:8、1:20、1:40制备，余下试管用为对照组，如阴性对照、抗原自凝对照等，试验完成后将凝集试管放在37度恒温箱中放置24-48小时后取出，在灯光下观察结果，最终确定血清稀释4倍的血清与抗原发生凝集效果明显。 实验路线（替换） 血清型鉴定 2、未知血清型试管凝集试验 以大鸡为例：将15种大肠杆菌血清准备好，在超净工作台操作，准备17支凝集用试管，做好标记，其中15支试管中血清分别稀释4倍并分装在15支试管中，剩下两试管分辨做阴性对照与阳性对照试验。试验完成后将凝集试管放在37度恒温箱中放置24-48小时后取出，室温下放置1-2h在灯光下观察结果。卵黄中提取的大肠杆菌均按以上方法检测。以下为观察结果图片。 实验路线 1、该实验在卵黄中分离出大肠杆菌，其感染途径可能为垂直感染。说明该仔鸡有可能在胚胎时期就已经感染大肠杆菌。也有可能是种鸡感染大肠杆菌病，经垂直传播感染鸡仔，导致鸡仔发病。 2、实验时，待检未知血清型大肠杆菌菌液浓度需达到100亿个/ml，如果菌液浓度不到则很有可能出现试管凝集贷现象，使结果不明显，检测不准确。 3、在试管凝集试验中，要尽量准备多的血清种类，这样能提高检测的广度，避免血清种类不够，无法获得检测结果。 讨论 （最好自己写） 结论 1、在菌液浓度为100亿个/ml时，血清稀释为1：4时，试管凝集实验效果较为明显。 2、本试验成功检测出从大鸡、小鸡卵黄蒂的大肠杆菌的血清型。 敬请各位老师批评指正！ 谢谢