基因工程5-2 (简要) 基因的分离、重组及重组体向受体细胞的导入.ppt

5.1.3 从真核生物分离纯化目的基因 从真核细胞直接分离基因难度很大，原因是： 第一，真核细胞中单拷贝基因只占染色体DNA很小一部分，大约10-5~10-7，因此从染色体直接分离纯化目的基因犹如大海捞针，机率很小； 第二，真核染色体DNA一般都很大，组建物理图谱和进行基因定位决非易事，因此不能对其进行直接分离； 第三，真核基因内一般都有间隔序列（又称内含子，intron），如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出了真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，由真核基因转录的mRNA也不能加工、拼接成为成熟的mRNA。 为了得到真核基因，一般是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA的克隆表达。 5.1.3.1 cDNA文库的构建 1. 总RNA提取 在真核细胞中，mRNA约为总RNA的1~5％，提取特异mRNA，需要选择特异而高度分化的组织。例如，胰岛素基因的mRNA在胰脏组织中含量丰富，珠蛋白基因的mRNA在血红蛋白细胞中含量丰富。因此，能否选择到富含某种特异mRNA的组织细胞，是获得大量纯化mRNA的关键。 mRNA的转录和加工在细胞核中进行，肽链合成在细胞质中进行。成熟的mRNA分子要转移到细胞质中进行转译。 从细胞