聚乙二醇修饰成纤维细胞生长因子鄄21降血糖作用.PDFVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2013, 40(4): 374~385 乙二醇修饰的成纤维细胞生长因子21 的降血糖作用* 叶贤龙 赵景壮 任桂萍 于 丹 刘铭瑶 于引航 李德山** ( 北农业大学生命科学学院生物制药教研室，哈尔滨 150030) 摘要 成纤维细胞生长因子-2 1(FGF-2 1)是FGF 家族的一员 现有大量研究表明，FGF-21 是除胰岛素以外的一种新的血糖调 节因子，有望成为治疗2 型糖尿病的新型药物 然而，FGF-21 在动物体内稳定性较差，半衰期较短，严重影响了其在临床 上的应用 为解决这些问题，本实验采用分子 量为20 ku 的单甲氧基聚乙二醇- 丙醛(mPEG-ALD)对鼠源FGF-21(mFGF-2 1) 进行N 端定点修饰，以改善mFGF-21 的性 (如提高体内半衰期、降低免疫原性等) 本文研究了反应pH 、反应时间、蛋白 质浓度及反应物之间的 量比对mFGF-21 与聚乙二醇(PEG)合成反应的影响 采用Capto Q 阴离子交换层析或Superdex 75 凝胶过滤层析分离纯化聚乙二醇化mFGF-2 1(PEG-mFGF-21)，并最终确定了mFGF-21 聚乙二醇修饰的反应条件和分离 PEG-mFGF-21 的纯化工艺 随后分别进行了PEG-mFGF-21 的理化性 (大小、纯度和体外稳定性)、免疫原性、体内半衰期、 体外葡萄糖吸收活性及体内降糖活性的研究 体外稳定性实验结果显示，mFGF-21 经PEG 修饰后温度稳定性和抗蛋白酶水 解稳定性都显著提高 间接ELISA 方法检测血清中mFGF-21 抗体水平及目标蛋白含量的结果表明，PEG 修饰mFGF-21 可明 显降低其免疫原性，延长体内半衰期 HepG2 细胞的葡萄糖吸收实验结果发现，PEG-mFGF-21 的细胞活性并没有下降，反 而随着刺激细胞时间的延长，经PEG-mFGF-21 刺激的细胞葡萄糖吸收显著高于mFGF-21 刺激的细胞葡萄糖吸收 2 型糖尿 病db/db 小鼠短期血糖调控实验结果表明，mFGF-21 降糖速度快于PEG-mFGF-21 ，但其持续时间较PEG-mFGF-21 短；长期 血糖调控实验结果显示，PEG-mFGF-21 长期降糖效果优于mFGF-21，作用持续时间长，并且PEG-mFGF-21 在停药后控制血 糖的能力也高于mFGF-21 综上所述可知，mFGF-21 的PEG 修饰在不影响其体外生物活性的前提下，能够提高mFGF-21 的 物理稳定性和抵抗蛋白酶水解的能力、降低免疫原性、增加体内稳定性、延长mFGF-21 在动物体内降血糖作用的效果和时 间 本实验为FGF-21 化学修饰提供了重要的技术平台，对以后FGF-21 的临床应用具有非常重要的意义 关键词 成纤维细胞生长因子-21(FGF-2 1)，聚乙二醇化，分离纯化，稳定性，免疫原性，2 型糖尿病，葡萄糖吸收 学科分类号 Q81，R9 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 12.00397 随着生物技术的迅速发展，越来越多的蛋白 苦，而且增加了治疗费用，同时也引发一系列副反 多肽药物用于疾病的治疗，如胰岛素、胰高血糖素 应，如外源性的蛋白 药物注入人体后往往会引起 样肽-1(GLP- 1)、干扰素、促红细胞生长素以及疫 一定的免疫反应等[4] 目前，已经建立的改善蛋白 苗等[1] 据统计，蛋白 多肽药物将以每年 10%～ 药物半衰期的技术包括：蛋白 药物的化学修 [2] 35%的速度增长 虽然蛋白 多肽类药物用量少， 饰、蛋白 融合、构建抗蛋白酶突变体、糖基化、 [3] 作用强，但蛋白 多肽药物在体内会被很快清除、 微囊化如纳米粒等 . 而采用聚乙二醇化(PEGylation) 稳定性较差、利用度低、而且易被胃肠道消化酶