曹凤明-微生物活菌计数方法-演示文稿2010.4.27.ppt

微生物活菌平板计数方法和技术 微生物肥料和食用菌菌种质检中心 曹凤明 微生物计数方法种类 直接计数法 核酸计数法 活菌计数法（培养法） MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法 混菌法 平板技术法 直接计数法 1. 显微镜直接计数 比浊法 3. 电子计数器计数法 1. 显微镜直接计数 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液 血球计数板：菌体较大的酵母菌或霉菌孢子 细菌计数板：一般细菌 用途：快速了解发酵液的菌数。常用于生产线上生产过程控制。 缺点：不易区分颗粒、死菌体和杂菌，计数与真实菌数有很大差异。不能作为正规计数方法。 核酸计数法 每一种生物都有一套自己独有的遗传物质，脱氧核糖核酸和核糖核酸，即DNA和RNA。随着核酸分析技术的发展，已经能够利用遗传物质对生物进行定性和定量的测定，而且更为灵敏、迅速、专一性强。 常用的方法：荧光定量PCR 此法操作精细繁琐，药品昂贵，而且经常受到死菌体的干扰。暂时不能成为微生物肥料活菌计数的常用方法， 活菌计数法（培养法） MPN（Most-Probable-Number ）最大可能数法（主要用于光合细菌和（粪）大肠菌群的测定） 混菌法（适用于兼性厌氧微生物的测定） 取1.0mL不同稀释度菌悬液于灭菌平皿内，将冷却至50℃左右的15~20mL培养基倒入培养皿内轻轻混匀，培养计数。 （食品中乳酸菌总菌数的测定） 平板计数法（最常用的方法） 平板计数法 使不可见的微生物在人工培养基平板上生长成为可见的菌落（CFU），从而可用肉眼进行观察、计数。较其他方法直观准确 ，是一种经典的检测活菌数的方法，也是目前国际上通用的方法。 制备一定体积的菌悬液，作一系列的倍数稀释，然后将定量的稀释液进行平板培养，根据培养出的菌落数，计算出样品中的活菌数。 平板计数法示意图 平板计数的优缺点 优点：直观、准确、可靠 该方法不仅可以检测到样品中的有效活菌数，而且可以检测到产品的微生物污染情况，即杂菌数。 缺点： 由于培养基和培养条件的局限性，所得的结果一般低于实际值。 平板计数法 （一）检测前的准备 （二） 操作过程（母液制备、系列稀释、加样、涂布、培养、菌落识别、计数） （三） 计算 （一）检测前的准备 根据菌种的特性选择方法 天平，摇床，酒精灯，培养箱，染色液，显微镜，灭菌锅，烘箱等 无菌间或洁净工作台消毒 吸管、刮刀、培养皿的洗涤、包扎、灭菌 制样和稀释用三角瓶水制备、灭菌 培养基制备和平板制备 平板制备 灭好菌的培养基冷却至50℃ 左右（以不烫手为宜），在无菌状态下倾注培养基。 倾倒平板前应将培养基摇匀，防止在瓶底有沉淀。但是摇动时要防止产生大量气泡。 通常条件下平板制备好后室温放置或温箱放置2~3天使用，目的：一可以检查培养基是否灭菌彻底，是否在倾倒过程被微生物污染；二为了使平板表面干湿适宜，防止菌落由于平板上的水滴运动而连片以致无法计数。 （二）操作过程 2.1 母液制备 2.2 系列稀释、加样和涂布 2.3 培养 2.4 识别和计数 2.1 母液（基础液）的制备 样品混合均匀：很重要 固体样品：称取10g左右样品加入到100mL无菌水（ 500mL三角瓶）中，静置20min。 液体样品：量取10.0ml样品加入到90mL无菌水（500mL三角瓶）中，静置20min 。 分散菌体：将三角瓶置于摇床上200r/min振荡30min，即成母液菌悬液。 2.2 样品稀释、加样和涂布 准备工作： 应将平板上做好标记，包括培养基种类，样品编号，稀释度/稀释倍数. 将小瓶无菌水写好样品编号、稀释度/稀释倍数 具体过程见GB20287-2006 农用微生物菌剂 2.2.2 加样和涂布 稀释、加样和涂布注意事项 整个程序应在无菌间或超净台内进行，操作人员时刻有无菌概念 适宜稀释度：根据标准或企业提供的信息选择稀释度。 系列稀释时不同的稀释度应更换吸管（移液管），加样和涂布不同稀释度时也要更换吸管和刮刀。 每个培养皿均要标明培养基种类、样品编号、稀释度 稀释和加样要准确，涂布均匀及时，使用的吸管量程要适宜。 无菌水对照，以检查吸管、刮刀以及稀释用水灭菌是否彻底、操作过程是否合乎无菌要求。 2.3 平板的培养 将涂布好平板放在适宜的条件下培养 如： 温度条件 气体条件 培养时间 平板倒置培养 2.4 菌落识别和计数 通过菌落识别、涂片染色、镜检观察，确定有效菌。（必要时做生化实验） 选择性培养基上长出的菌落并非都是有效菌，培养基的选择性是相对的。 一种有效菌只在一种特定培养基上计数