高中生物核心概念高考复习课件-PCR技术.pptVIP

PCR技术的反应条件 PCR的特点 灵敏度高 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 病毒检测的灵敏度可达3个RFU 细菌检测的最小检出率为3个细菌 简便、快速 一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR操作（录像） PCR中其它注意的事项 1.防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管(离心管)一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 2.设立对照： 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板、无模板 试剂对照： 除模板外的所有组分 PCR应用举例 1、在PCR产物两端添加限制性酶切位点 在PCR引物的5’加上根据需要而设计的酶切位点，PCR产物内部无该切点。 在酶切位点的5’加3个左右的保护碱基，其数目多少取决该酶的性质。 PCR产物经电泳回收后，直接用限制酶进行切割，纯化后与目标载体连接重组。 该法适用于直接将PCR产物克隆到表达载体进行功能研究，但构建好的表达载体必须测序才能证明PCR产物的身份正确且没有突变。 * * 2、TA克隆 这是目前最通行的PCR产物克隆方法，基本思路是先将PCR产物与特制的T载体进行连接重组，测序证明正确无误后，再从T载体上亚克隆到表达载体上进行功能研究。