实验方法和步骤详解.PDF

实验方法与步骤详解 实验方法与步骤详解 细胞培养的一般过程 |原代培养 |传代培养 |肿瘤细胞培养 |细胞系或细胞株的建立 |个别组织细胞的培养 | 细胞培养技术 细胞计数及活力测定 |细胞的分裂指数 |细胞周期的测定 |细胞的冻存和复苏 外周血培养基配制 |细胞学技术的一般环节 |人类外周血染色体制备 |骨髓细胞染色体标本的制备 |羊水细 染色体技术 胞染色体标本的制备 |胸腹水染色体标本制备 |染色体GTG标本制备 | 染色体CBG标本制备 |人类染色体姊 妹染色单体差别染色 |核仁组织者区的AgNO3染色 |人体间期细胞X—小体的制备 真核细胞DNA的制备与定量 |质粒DNA的碱裂解法提取与纯化 |λ噬菌体DNA提取 |DNA分子的限制性 内切酶消化|DNA 片段回收与纯化 |目的基因的亚克隆|PCR |引物参数计算 |PCR 产物的克隆 |DNA序列测 分子生物学技术 定 |Southern杂交 |PCR-SSCP |细胞凋亡 |RNA操作中的一般要求 |RNA 的制备|mRNA 的分离与纯化|RT- PCR |Northern BlotRPA |ddPCR原位杂交|| |原核表达 |蛋白SDS电泳 |Western表达蛋白的分离与纯化| |表达 蛋白的生物学活性的检测 |真核转染 /Protocol/home.htm2004-2-12 21:25:38 细胞培养的一般过程 细胞培养的一般过程 一、准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的 清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。 二、取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株 的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。 理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培 养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应 严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。 由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。 三、培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养 基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿 后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。 正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指 示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。 一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞 长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株 则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。 培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。 四、冻存及复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度— －196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般 为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。 复苏一般采用快