基因工程课件2——实验1：质粒dna的小量制备.pptVIP

基因工程实验技术 实验一 质粒DNA的小量制备 实验目的要求： 1、掌握用碱裂解法小量制备质粒DNA 2、了解制备原理及各种试剂的作用 一、背景知识（载体及质粒） 二、实验原理（碱裂解法） 三、实验材料 四、实验步骤 五、预期结果 六、注意事项 一、背景知识——载体及质粒 1、载体功能： 为目的基因提供进入受体细胞的转移能力。 为目的基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。 为目的基因提供在受体细胞中扩增和表达能力。 2、载体种类 质粒、噬菌体、腺病毒载体、逆转录病毒载体…… 3、理想载体的基本条件 可转移性 合适的复制位点 多克隆位点：广泛、特异 选择标志，便于筛选和鉴定 分子较小，可容纳较大的外源DNA 4、质粒 （1）特点： 存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子。 具有自我复制功能。 带有抗性基因及表型识别等遗传性标记物。 经改造后具有多克隆位点。 举例：pMD-18T质粒 二、碱裂解法小量制备质粒DNA原理 碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 碱裂解法提取质粒主要包括三个部分： （1）裂解细胞 加入碱性SDS，破壁与膜，处理的同时也能去除细胞碎片、染色体DNA等杂质。碱性SDS法相对较剧烈，只能抽提小于10 kb的质粒。 （2）分离 当溶液的pH值调节到大于12时，双链DNA中的氢键被破坏，于是染色体DNA双链分离成单链；而超螺旋状态的质粒DNA仅仅部分氢键被破坏，只是部分双链解离成单链。 再将溶液的pH值调回中性时，单链DNA互相缠绕并且与蛋白质结合生成网络状大分子，而超螺旋的质粒发生复性反应后仍然是小分子，通过离心很容易将两者分开。达到分离的目的。 （3）纯化 细胞裂解液中的杂质除了染色体DNA外，还有各种细胞壁、膜的碎片、各种酶与其他蛋白质、脂质类杂质以及RNA等。 离心去除各种细胞碎片； 用酚处理去除蛋白质，包括各种酶； 用RNA酶处理去除RNA等。 氯仿有强烈的溶脂性，可去除脂质类杂质。氯仿能将微量的溶于DNA水溶液中的酚抽提掉。 异戊醇减少泡沫，使分层明显 无水乙醇沉淀法去除水溶液中的痕量酚、氯仿等。沉淀DNA时加入盐类的目的是中和链上的电荷，使DNA易于形成沉淀。 70%乙醇进行洗涤DNA沉淀，去除盐类等溶于水的物质。 溶液I、II和III的作用： 溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris?Cl组成。 葡萄糖——增加溶液的粘度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA； EDTA——络合掉Mg2+等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用； Tris?Cl——能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。 溶液II：由SDS与NaOH组成。 SDS——破细胞膜及壁，解聚核蛋白，并与蛋白质分子结合使之变性； NaOH(pH12)——破坏氢键，使DNA分子变性，同时强碱也使蛋白质变性，减轻核酸酶对质粒DNA的降解作用的可能性。 溶液III：由KAc与HAc组成，是pH值为4.8~5.5的高盐溶液。 中和溶液II的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K+离子会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离，此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。 三、实验材料 1、仪器和材料 大肠杆菌(E. coli)单菌落或冻存菌种。 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、Ep（Eppendorf）管（1.5 mL微量离心管）、取液器（20 μL~l mL）、吸头。 四、实验步骤 （三）纯化质粒DNA 五、预期结果 若所取菌液量大，一般经乙醇沉淀离心后，肉眼会看到Ep管壁一侧有灰白色沉淀物，其定性及定量需进行电泳检测。 六、注意事项 l、提取质粒DNA的各个步骤应始终在低温下进行。 2、实验时防止DNA酶的污染，避免DNA降解。如，不要讲话；注意Ep的管的操作，防止手接触内部；枪头用完，随时关上盒盖。 3、注意离心机、取液器的正确使用。 4、注意酚、氯仿的腐蚀性，戴手套操作，接触过的枪头勿乱扔。 * * * * * * * * 宿主细胞 ori 抗Amp 宿主细菌 含Amp培养基 多种酶切口 多克隆位点 限制性内切酶 单一酶切口 多克隆位点 ori 复制起始点 遗传标记 Amp polylinker 基因载体 PMD-18T质粒的物理图谱 2、试剂 (1) DNA提取溶液（溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，见附录） (2) TE缓冲液（pH 8.0）