牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白ErnsE2的原核表达及噬菌体展示anti-BVDV纳米抗体文库的构建.pdfVIP

课 题 来 源 课题名称:国际合作项目（牛病毒性腹泻/粘膜病防治新技术） 课题编号:2013DFR30970 中文摘要 牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovineviral diarrhea/mucosaldisease）是由牛病毒性腹泻病毒引起的、 主要发生于牛的一种急性、热性传染病，其临诊特征为黏膜发炎、糜烂、坏死和腹泻。本病呈世界 性分布，广泛存在于欧美等许多养牛业发达的国家。自1980年以来我国从国外引进奶牛和种牛，将 本病传入我国，并对病毒进行了分离鉴定。发达国家针对感染牛群多采取大量淘汰或屠杀，目前尚 无有效的疫苗对BVDV 进行预防，给畜牧业生产造成巨大的经济损失，促使人们不断寻求新的防治 BVDV的途径，以便更好的控制该病的发生和流行。 自杂交瘤细胞技术问世，单克隆抗体已被广泛用于疾病的诊断和治疗。抗体来自于有机体，使 用过程中无毒性，在人们看来抗体用于治疗疾病似乎具有无限的潜力。然而传统的单克隆抗体依然 存在各种缺陷，比如：体积大、稳定性差、制备工艺繁琐、耗资高、必须人源化等。驼科动物和鲨 鱼体内存在一种特殊的天然缺失轻链的重链抗体。这种重链抗体的可变区序列具有体积小、容易获 得、高水溶性和稳定性、能够识别沟槽或缝隙间的抗原表位及结合活性好等优点，被称作是单域抗 体，又称纳米抗体。鉴于单域抗体的这些优点，已被广泛应用于临床诊断和治疗。 rns 本项研究根据GenBank公布的BVDV-NADL 株E (E0)、E2基因的核苷酸序列，设计引物，采 rns rns 用PCR技术从pACNR/NADL质粒中扩增E 、E2基因，构建原核表达质粒pET-32a-E 、pET-32a-E2， 将其转化至大肠埃希菌BL21中，经IPTG 诱导，用SDS及Westernblot检测目的蛋白的表达 情况及其反应原性。将牛病毒性腹泻病毒接种长满单层的MDBK 细胞，接种72h后，收取病毒液。 将全病毒灭活，免疫双峰驼。分离外周血淋巴细胞，并提取总RNA，反转录成cDNA。采用巢式PCR 技术扩增重链抗体可变区基因的核苷酸序列，构建噬菌体展示载体，经过多次连接转化TG1感受态 细胞，构建初始文库。利用M13KO7辅助性噬菌体超感染构建噬菌体展示anti-BVDV 纳米抗体文库。 rns 本试验成功构建牛病毒性腹泻病毒囊膜蛋白E 、E2的原核表达载体，经诱导表达目的蛋白分 别为45KD、64KD 左右，经Ni-NTA蛋白纯化仪纯化蛋白，获得纯度较高的蛋白。Western blot试验 表明目的蛋白具有很好的反应原性。以cDNA为模板，扩增驼源重链抗体可变区序列，构建库容量 5 11 为4.32×10 初始文库。辅助噬菌体救援后，获得噬菌体展示纳米抗体文库，滴度达1.3×10 。为后 rns 续利用BVDV 的囊膜蛋白E 、E2作为抗原筛选具有高亲和力、高特异性的抗BVDV 的纳米抗体奠 定基础。 rns 关键词：牛病毒性腹泻病毒（BVDV）；E 、E2蛋白；纳米抗体；噬菌体展示文库 I Abstract Abstract AAbbssttrraacctt Bovine viral diarrhea /mucosal disease (BVD-MD), caused by BVDV is an acute feverish an