玉米耐旱功能标记开发及优异单倍型应用.pdfVIP

玉米耐旱功能标记开发及优异单倍型应用 摘 要 玉米(Zea Mays L.)是全球重要的粮食、饲料和工业原料作物之一，在农业经济发展及人类粮食安全中占有举足 轻重的地位。然而，干旱严重影响了玉米生产的可持续发展。玉米种质资源中蕴藏有丰富的基因等位变异，通过关 联分析方法不仅可以检测到功能单核苷酸多态性 （SNP）变异位点，而且可以发掘与耐旱密切相关的优异等位基因变 异，然后根据基因的变异信息和遗传变异规律开发功能性分子标记，从而用于玉米耐旱分子标记辅助选择育种中。 本研究以我国玉米生产上常用的 210 份自交系为试验材料，根据全基因组关联分析结果，针对与耐旱有关的功 能位点进行标记开发，在不同种质背景中进行耐旱性验证。同时，对已经鉴定出含耐旱优异单倍型的玉米Zmivr2 基 因，构建新型高效表达载体，转化并创制耐旱新品种。获得的主要研究结果如下： （1）根据全基因组关联分析结果发现，有29 个SNP 位点至少与1 个或多个环境下的2 种表型性状相关联并且 与耐旱或耐旱响应基因有关。其中，编号为PZA0355.1 和PZA01671.1 的SNP 更是与多个耐旱性状表型密切相关。 通过生物信息学分析表明PZA0355.1 含有G/A SNP 变异位点，其注释基因为dhn1 ，位于6 号染色体；PZA01671.1 同样为A/G SNP 变异位点，其注释基因为rsp41 ，位于5 号染色体。基于这两个功能SNP 变异位点可分别开发CAPS 标记dhnC397 和rspC1090 ，用于分析和验证不同种质材料的耐旱性。 （2 ）在dhnC397 标记中，对210 份玉米自交系进行基因型验证，发现有205 份自交系能扩增出大小为 164 bp 目的片段。经过StyI 酶切后，53 份自交系被酶切成大小为131 bp 和33 bp 的两条片段，与此同时138 份自交系由于 缺少酶切识别位点而未被切开。然后对这 205 份自交系进行耐旱性综合评价，将试验材料分为高度耐旱，耐旱，中 等，干旱敏感和高度干旱敏感5 种类型。研究发现，在G 等位变异自交系中含有7 份耐旱自交系和24 份旱敏感自交 系所占比例分别为12.7%和43.6% ；在A 等位变异自交系中含33 份耐旱自交系和53 份旱敏感自交系所占比例分别为 23.7%和38.1% 。由此看出含A 等位变异自交系的耐旱性优于G 等位变异自交系的耐旱性。通过分析耐旱选择指标发 现无论属于哪种等位变异，杂种优势群B 的自交系耐旱性要强于杂种优势群A 的自交系。 （3 ）在rspC1090 标记中，有204 份自交系能扩增出286 bp 大小的目的片段。经过HpaII 酶切后，108 份自交系 被酶切成含有225 bp 和61 bp 的两条片段，而有87 份自交系没有被切开。对这204 份自交系进行耐旱性评价分析发 现在G 等位变异自交系中含有30 份耐旱自交系和31 份旱敏感自交系分别占比例的27.8%和28.7% ；在A 等位变异 自交系中含10 份耐旱自交系和47 份旱敏感自交系分别占总比例的11.6%和54.7% 。因此，含G 等位变异自交系的耐 旱性强于含A 等位变异的自交系。此外，通过进行耐旱选择指标分析，同样发现属于杂种优势群B 的自交系耐旱性 都要强于杂种优势群A 的自交系。 （4 ）通过对候选基因Zmivr2 关联分析，鉴定出优异单倍型。在此基础上进一步研究Zmivr2 基因编码蛋白质结 构特征。通过SOPMA 软件分析Zmivr2 基因蛋白质二级结构，发现该基因主要是由α 螺旋（11.74% ），延伸链（24.07% ） 和随机卷曲 （64.19% ）组成。采用SWISS-MODEL 软件对含优异单倍型和普通Zmivr2 基因的三级结构进行预测，再 用SPDBV 4.01 软件对比其三级结构可看出两者空间结构上存在一定的差异，其中在259 处由精氨酸突变为赖氨酸， 在414 处由半胱氨酸突变为精氨酸，因此含优异单倍型的Zmivr2 基因可能在植物耐旱上起一定的作用。 （5 ）通过In-Fusion PCR 克隆技术成功构建含有优异单倍型的Zmivr2 基因植物过表达载体pCUB-ubi-Zmivr2 。 然后以玉米自交系昌7-2 为供体材料进行农杆菌介导的遗传转化，经PCR 检测有1 株为阳性并结实。将获得的30 粒 T1 代昌7-2 转基因种子种植于温室待其生长到3-4 叶期进行PCR 检测，其中有4 株呈现阳性。然后，将收获的4 株