HPLC定量分析方法_培训课件.ppt

电导检测器：用于离子色谱 极谱检测器 库仑检测器 安培检测器 电化学检测器 伏安检测器 能氧化、还原的物质 检测限达10-12 g /ml，痕量组分分析 特点： 通用型检测器 对多数物质的灵敏度低（约10-5 g /ml），不能用于痕量分析 适合于糖类的检测（检测限可达10-8g /ml） 受环境温度、流动相组成等波动的影响大，不适合梯度洗脱 示差折光检测器 高选择性、高灵敏度的新型检测器 是分析微量脂质、核酸、生物胺的最佳选择 化学发光检测器 HPLC-MS能提供的质谱信息 准确的化合物分子量信息 未知化合物碎片结构信息 一套完整的图谱和多种扫描方式充分提供定性、定量和峰纯度信息 可用于无共价键、无功能团的化合物 质谱检测器 几种检测器的主要性能 化学键合相色谱法 BPC（最广泛） 胶束色谱法 MC 手性色谱法 CC HPLC法分类及方法 借助于化学反应的方法将固定液的官能团键合在载体的表面而构成化学键合相。 化学键合相色谱法 反相键合相色谱法 正相键合相色谱法 离子对色谱法 离子抑制色谱法 反相键合相色谱法 适用于非极性与中等极性的化合物 非极性键合相：十八烷基键合相是最常用的固定相（ODS) 05版药典一部 流动相：水+极性调节剂 正相键合相色谱法 适用于溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。如：酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等 常用的极性键合相：氰基（－CN)、氨基（－NH2)和二醇基(DIOL) 常用的流动相：烷烃（常用正己烷）+极性调节剂 极性调节剂：乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等 氰基键合相：分离选择性与硅胶相似，对双键异构体或含双键数不等的环状化合物的分离有较好选择性 氨基键合相：较强的氢键结合能力，对含有甾体、强心苷等官能团的化合物有较好的分离能力；与糖类分子的羟基产生选择性。 氨基柱用作分析糖类的专用色谱柱，但不能用于分离羰基化合物，如甾酮、还原糖等。因为存在Schiff碱反应。 正相键合相色谱法 含义：直接将离子对试剂加入到流动相中，用以分离离子型或可离子化化合物的方法称为离子对色谱法。 分类：反相离子对色谱法;正相离子对色谱法 反相离子对色谱法：以C18或C8键合相为固定相，含离子对试剂的有机溶媒－水溶液为流动相 适用于有机酸、碱、盐的分离 离子对色谱法 1.离子对试剂的选择：选用的离子对试剂的电荷应与试样离子的电荷相反。 分析碱类或带正电荷的物质：用带负电荷的烷基磺酸盐或烷基硫酸盐 如：己烷基磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等 分析酸类或带负电荷的物质：用带正电荷的季胺盐 如：四甲胺、四丁胺、十六烷基三甲胺、三辛胺等 离子对试剂的浓度一般为：3-10mmol/L 反相离子对色谱法 2.流动相ph值的控制 调节ph值可在较大范围内改变弱酸、弱碱样品的保留值和分离选择性 因采用的是以硅胶为基体烷基键合相，流动相的ph应在2-8范围内调整 3.有机溶剂的选择：甲醇－水；乙腈－水系统 反相离子对色谱法 反相离子对色谱法特点 采用反相键合液相色谱柱，在一般的HPLC仪器上就可运行，它兼有反相色谱和离子交换色谱共同的优点，分析速度快，效率高，操作简便。 适用于有机酸、生物碱的分离，以及用离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物的分离。 缺点：离子对试剂价格较贵。 离子抑制色谱法 定义 通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）、或缓冲盐（常用磷酸盐及醋酸盐），调节流动相的pH值，抑制组分的离解，增加组分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以达到分离有机弱酸、 弱碱的目的。这种技术叫离子抑制色谱法。 离子抑制色谱法通常用于反相键合相色谱中，组分的保留值除与一般的反相键合色谱法有相同的影响因素外，还受流动相的pH值影响。 流动相的PH值要在2-8之间 离子抑制色谱法特点 离子抑制色谱法与离子对色谱法的区别 1.离子抑制色谱法是向流动相中加入抑制剂以抑制组分自身解离。所加抑制剂为低分子有机或无机弱酸、弱碱或盐。抑制子（反离子）是样品本身所具有的离子。 2.离子对色谱法则是向流动相中加入离子对试剂。离子对试剂是有机两性化合物、表面活性剂。离子对试剂的反离子与组分离子结合成中性离子对。 一、定量方法 二、方法学建立 HPLC的定量方法 二、方法学建立 （一）专属性 （二）线性关系考察 （三）精密度试验 （四）准确度试验 （五）稳定性试验 （六）检测灵敏度及检测限的测定 1.根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 2.选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格(柱内径及柱长)和选用固定相(粒径及孔径)。 3.根据被分析样品特性选择合适的检测器。 4.优化分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方法。 5.