2016分子肿瘤概论研究生学生_培训课件.ppt

Real-time PCR RT-PCR 3.基因芯片技术 (四)基因突变的检测方法 1.聚合酶链反应-单链构象多态性分析（Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products , PCR-SSCP） 长度相同，构象不同 在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳 迁移率（泳动率）不同 碱基序列不同的单链DNA构像改变 基本方法 作PCR 将产物变性而成为单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果 可用同位素/荧光素标记 非同位素标记 2.PCR-限制性片段长度多态性（restrection fragment length polymorphisms , RFLP）分析技术 基本原理 --序列中一个碱基发生改变 --使原来的内切酶位点消失 或产生新的酶切位点 --用限制性内切酶消化PCR 扩增出来的DNA片段 --检测其酶切片段长度的差异 3.变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) 基本原理 电泳时，不同浓度凝胶温度不同 DNA链中有一个碱基改变 在不同的温度发生解链 电泳迁移率改变 4. DNA 序列分析（DNA sequencing ） 5. 荧光原位杂交 ( FISH) 6． DNA 芯片技术（DNA chip ） （五）肿瘤的微卫星不稳定性分析 微卫星不稳定性（microsatellite instability , MI）, 是指简单重复序列的增加或丢失 PCR + DNA 序列凝胶电泳 （六）肿瘤易感性检测 采用相应基因变异方法进行检测 （七）肿瘤相关病毒 核酸杂交技术与PCR技术 (八) 基因重组技术 主要目的是获得某一基因或DNA片段的大 量拷贝 (九) 基因转染（gene transfection）技术 （十）RNA干涉(RNA interference） 核酸杂交/PCR技术与蛋白表达【免疫组化/荧光、流式细胞术、WB方法结合、蛋白结合检测方法 】 蛋白表达 在翻译水平上定位研究基因表达 核酸杂交/PCR技术 检测DNA/RNA， 在基因或转录水平研究基因表达 （十一）DNA-蛋白质结合检测 1.凝胶阻滞实验（Gel retardation assay） DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay）或条带阻滞实验（Band retardation assay） 基本 原理： 在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 中， D N A和蛋白质的复合物的迁移速度比单一的 D N A片段或双链的寡核苷酸慢 反应产物 电泳分析 D N A与蛋 白质结合的特异性通过非标记D N A竞争性实验来确定 2.足迹实验（foot-printing assay） 原理： 当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割,而不产生出相应的切割分子, 在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”. 3.染色质免疫共沉淀技术 （chromatin immunoprecipitation assay, CHIP） 基本原理： 在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 （十二） 激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection，LCM) 显微镜直视下 组织切片 确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞 （十三）共聚焦激光扫描显微镜技术(Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM) 细胞“CT” ，上世纪80年代 --组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态改变 应用 能观察各种荧光标记的 --组织（包括活组织） --培养细胞 --粘附细胞 --细胞涂片 --石蜡切片 --冰冻切片 * * * * * * * * * * (2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶 ①丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子 纤维蛋白溶解酶(纤溶酶) 纤溶酶原 a. 降解基质 如纤维蛋白，FN, LM, 蛋白多糖 b. 激活胶原酶 胶原降解 尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokin