破壁灵芝孢子粉多糖含量测定.docxVIP

2.2? UV-VIS法测定灵芝孢子粉中灵芝多糖的含量[5-8]　　2.2.1? 测定波长的选择? 精密量取标准品储备液2mL，置25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后，精密量取2mL，置具塞试管中，精密加入硫酸-蒽酮溶液(精密量取蒽酮0.1g，加入80%的硫酸溶液100mL中，使溶解，摇匀)6mL，摇匀，置沸水浴中加热15min，取出，放入冰浴中冷却15min，取出。同时以蒸馏水2mL平行操作，作为空白，在400～800nm范围内对标准品溶液进行波长扫描。结果在波长625nm处有最大吸收，如图3，因此实验测定波长为625nm。图3 葡萄糖标准品的UV图谱　　2.2.2? 标准品储备液的制备? 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖0.0744g，置100mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得。　　2.2.3? 样品溶液的制备? 取灵芝孢子粉约0.6g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加水90mL，加热回流3h，放冷，摇匀，离心，提取液转移至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10mL，加入乙醇150mL，摇匀，4℃放置12h，取出，离心，倾去上清液，沉淀加水溶解并转移至25mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得样品溶液。2.2.4? 标准曲线? 精密量取标准品储备液0、1、2.5、3.5、4、8mL，分别置50mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液2mL，置具塞试管中，精密加入硫酸-蒽酮溶液6mL，置沸水浴中加热15min，取出，放入冰浴中冷却15min，以第一管为空白，在625nm波长处测定吸光度，以标准品浓度X(μg/mL)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。经计算得回归方程为Y=0.0091X，r=0.9991，对方程检验，F=148.902，P0.01，有统计学意义。结果表明，在14.9～119.1μg/mL的范围内，葡萄糖标准品溶液浓度与吸光度线性关系良好。标准品的UV图谱见图4A。　图4灵芝多糖UV谱图 A-葡萄糖标准品 B-样品　　2.2.5? 精密度试验? 精密量取标准品储备液2mL，置25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后精密量取2mL，按照“2.3.2”项下方法显色，在625nm处测定吸光度，连续测定5次，吸光度平均值为0.5654，RSD为0.24%，表明方法精密度良好。　　2.2.6? 稳定性试验? 精密量取标准品储备液2mL，置25mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀后精密量取2mL，照“2.3.2”项下方法显色，每隔0、5、10min、20、30、40、60分钟测定标准品溶液在625nm处的吸光度值，至第30分钟时，5次测量结果吸光度平均值为0.5575(n=5)，RSD为0.72%，结果表明，显色在30min之内稳定。　　2.2.7? 回收率试验? 取灵芝孢子粉样品5份，每份约1g，精密称定后分别加入一定量的葡萄糖标准品，按照“2.3.3”项下方法进行制备，在625nm处测定吸光度并计算加样回收率，结果见表3。　　2.2.8? 样品测定? 将样品溶液照“2.3.2”项下的方法显色，在625nm处测定吸光度并计算含量，结果见表4，样品UV图谱见图4B。表3加样回收率测定结果（%， n=5，±s）Tab. 3 Recoveries of polysaccharides constituents （%，n=5，±s）批号取样量（g）样品中灵芝多糖含量（mg）添加葡萄糖标准品含量（mg）实测灵芝多糖含量（mg）回收率（%）±sRSD（%）??200504071.1713.4810.5724.63102.4?101.4±3.1??3.141.0812.4410.5722.7198.70.8910.2510.5721.61103.81.2113.9410.5725.51104.11.1413.1310.5723.1397.6表4含量测定结果（%，n=5，±s）Tab. 4 Contents of samples （%，n=5，±s））批号含量RSD（%）200504071.152±0.021.74200508121.129±0.032.66200511031.007±0.021.99???　　3? 讨论　　对灵芝三萜类成分的含量测定采用HPLC法。用HPLC法测定了灵芝孢子粉中灵芝酸C2的含量，标准品其纯度经HPLC检查，大于98%，符合标准品的要求。选择流动相时，甲醇与水的配比对样品的分离影响较大，结果表明甲醇比水55∶45的配比在本实验条件下较为合适。加入1%的冰醋酸的目的是为了减少峰的脱尾。另外在样品提取处理时，对超声、回流时间进行了考察，比较了超声15min及30min，回流1h、4h、9h的提取效果。测定结果表明超声30min、回流4h已将样品提取完全，并且杂质较少，从而