综合性实验植物DNA的提取及电泳.docVIP

本科学生综合性实验报告 学号： 124120434 姓 名： 刘云谣 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12生物技术 实验课程名称：植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作 教 师： 郝大海 开 课 学 期： 2014 至 2015 学年 上 学期 云南师范大学教务处编印 实验序号 一 实验名称 植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作 实验时间 第十五周 实验室 睿智3--428 实验目的 1、了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤 2、掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法 3、掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法 4、了解PCR原理，熟悉操作步骤 5、掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法 二、实验原理 1、DNA提取的原则： （1）保证DNA一级结构的完整性 （2）排除其它分子的污染RNA(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来. 3、分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:（1）、用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.（2）、用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.（3）、用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀 4、DNA提取方法： （1）CTAB法原理：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物0.7mol/L NaCl），该复合物可溶。之后用有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质DNA。注意CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 （2）SDS法 SDS 阴离子去垢剂在高温（5565℃）下裂解细胞，蛋白变性，染色体离析，在高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴）使蛋白质及多糖杂质沉淀DNA用酚/氯仿抽提，最后乙醇沉淀水相中的DNA。 5、DNA质量检测：紫外分光光度计检测法，嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度。 6、琼脂糖电泳：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。 7、PCR实验原理 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 三、实验设备及材料 （一）、仪器设备 1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒、恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪 （二）、试剂 CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dN